人生如戲,相信長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)也體會(huì)到了。之前一直遭冷遇,如今卻是萬(wàn)人迷。其實(shí),人類(lèi)及其他哺乳動(dòng)物的基因組轉(zhuǎn)錄了數(shù)萬(wàn)條lncRNA。根據(jù)GenCode數(shù)據(jù)庫(kù)中版本的數(shù)據(jù),人類(lèi)基因組中包含16,000條lncRNA,產(chǎn)生了近28,000條轉(zhuǎn)錄本。再加上其他數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù),目前已知的lncRNA超過(guò)40,000條。
這些類(lèi)似mRNA的轉(zhuǎn)錄本在各種基因調(diào)控水平和胚胎發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。越來(lái)越多的證據(jù)也表明,異常表達(dá)的lncRNA在多種疾病狀態(tài)中發(fā)揮重要作用,如癌癥。這些RNA盡管在十幾年前就已經(jīng)發(fā)現(xiàn),但只有少數(shù)分子的功能得到鑒定。
德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的藥理學(xué)教授David Corey表示:“你必須從檢測(cè)非編碼轉(zhuǎn)錄本開(kāi)始。”他的研究方向是將lncRNA作為藥物靶點(diǎn)。“我對(duì)這些數(shù)據(jù)庫(kù)不感冒,因?yàn)榭赡艽嬖阱e(cuò)誤。他們可能檢測(cè)到你的細(xì)胞系中不存在的RNA或很少量的RNA。”
若并非全基因組范圍內(nèi)的檢測(cè),Corey博士通常利用定量PCR來(lái)檢測(cè)非編碼轉(zhuǎn)錄本。“如果我們認(rèn)為那兒有一條非編碼轉(zhuǎn)錄本,我們就用5’和3’ RACE來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)這些區(qū)域,”他說(shuō)。“了解它的起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)是件好事,但不一定是必需的。如果你主要對(duì)功能感興趣,那么就不用了解全部情況,若存在重疊的轉(zhuǎn)錄本,檢測(cè)起來(lái)也比較困難。”
如果轉(zhuǎn)錄本的確存在,下一步則是利用逆轉(zhuǎn)錄來(lái)生成RNA,“或者購(gòu)買(mǎi)一條適當(dāng)長(zhǎng)度的RNA,但是序列必須相同,”Corey博士說(shuō)。“你必須使用*相同的qPCR引物,否則失之毫厘,謬以千里。”
當(dāng)然,與mRNA相比,分析這些lncRNA面臨*的挑戰(zhàn)。據(jù)ArrayStar的資深科學(xué)家Yanggu Shi介紹,lncRNA的豐度水平通常比mRNA低十倍,而且組織特異性高,近80%的lncRNA是組織特異的,但mRNA不到20%。lncRNA的注釋比較少,因?yàn)樗鼈儾痪幋a蛋白質(zhì)。此外,一些lncRNA沒(méi)有poly(A)尾。它們大多位于細(xì)胞核中。“基于這些原因,我們需要一些特殊方法來(lái)分析和注釋?zhuān)?rdquo;Shi博士說(shuō)。ArrayStar專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā)分析RNA表達(dá)和調(diào)控的工具,特別是調(diào)控性的非編碼RNA。
舉個(gè)例子,RNA測(cè)序通常產(chǎn)生4000萬(wàn)條序列,但lncRNA的測(cè)序覆蓋度太低,不足以進(jìn)行可靠定量。“利用這種方法,lncRNA測(cè)序至少需要1億條序列,比常規(guī)的mRNA測(cè)序要多得多,”Shi博士解釋道。“相比之下,芯片受低豐度轉(zhuǎn)錄本的影響沒(méi)那么大,且錯(cuò)誤定量的幾率較低。”
據(jù)Shi博士介紹,ArrayStar的lncRNA芯片帶有許多注釋?zhuān)玫綄?shí)驗(yàn)支持,并被許多文獻(xiàn)引用。比如,ArrayStar芯片曾出現(xiàn)在《Nature Cell Biology》的一篇論文中,說(shuō)明三陰乳腺癌中的細(xì)胞質(zhì)LINK-A lncRNA激活了常氧下的HIF1α信號(hào)通路1。