細(xì)菌提取柱式法試劑盒它具有下列特點(diǎn):
1. 操作更加簡(jiǎn)單快速，省去了費(fèi)時(shí)的離心步驟。一般只需30-40分鐘完成。
2. 既可用于革氏陰性細(xì)菌，也可用于革氏陽(yáng)性細(xì)菌。
3. 所得RNA純度更高，OD260/OD280一般在2.0左右。
4. 一般不含基因DNA和蛋白質(zhì)污染。
5. 性價(jià)比高于進(jìn)口同類產(chǎn)品，適用于各種革氏陰性細(xì)菌。
6. 可用于后續(xù)RT-PCR、Northern Blot、芯片分析、體外翻譯、polyA篩選和RNase保護(hù)分析等試驗(yàn)。
細(xì)菌提取柱式法試劑盒使用方法
注意：試驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、耗材等均需要 RNase-free。操作步驟是針對(duì) 在 1.5 mL 塑料離心管中進(jìn)行的微量提取。
1. 新鮮配制溶菌酶溶液：根據(jù)樣品數(shù)量用自備的 TE 緩沖液和本試劑盒提供的溶菌酶干粉配制合適體積的、濃度為 4mg/mL 的溶菌酶溶液，放冰 上待用。一次革氏陽(yáng)性細(xì)菌 RNA 小量提取需要 100uL 溶菌酶溶液，一 次革氏陰性細(xì)菌 RNA 小量提取需要 10uL 溶菌酶溶液。未用完的溶菌酶 溶液不建議保存后重復(fù)使用。
2. 在 1.5 mL 塑料離心管中離心收集 0.2-1.5 mL 新鮮細(xì)菌（細(xì)菌總數(shù)不 得超過(guò) 1×10E9 個(gè)細(xì)菌）。注意:由于細(xì)菌 RNA 半衰期十分短，只有 2-5 分鐘，所以必須使用鮮的、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌才能提到高 質(zhì)量的 RNA。細(xì)菌必須立即使用，不能靜置。
3. 吸盡液體培養(yǎng)基，如果是革氏陽(yáng)性細(xì)菌，則加入 100uL 第 1 步制備的 4mg/mL 的溶菌酶溶液，*重懸細(xì)菌，常溫放置 5-10 分鐘。如果是 革氏陰性細(xì)菌，則加入 90uL TE 緩沖液和 10uL 第 1 步制備的 4mg/mL 的溶菌酶溶液，*重懸細(xì)菌，常溫放置 3-5 分鐘。
4. 加入 0.3mL 溶液 A，用槍充分吹打細(xì)菌沉淀，確保細(xì)菌全部裂解，沒(méi)有 塊狀物。此時(shí)裂解物總體積是 0.4mL。
5. 加入約 0.2 倍體積的自備(10.4mL 裂解物需 0.1 mL )，振蕩器 上充分振蕩混均 30 秒。
6. 12000-15000 g 室溫離心 3 分鐘。
7. 將上清液（約 0.3mL）轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。注意：離心后下層有機(jī)相 和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污 染。
8. 加入等體積（約 0.3mL）的溶液 B，充分混勻后全部上柱。
9. 12000-15000 g 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。
10. 加 0.7 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫離心半分鐘，棄收集管中 的 穿透液。一次洗滌一般足夠去除雜質(zhì)。但如果樣品 OD260/280 比 值不高，可以再用 0.3 mL 通用洗柱液重復(fù)此步一次。
11. 室溫 12000-15000 g 離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的通用洗 柱液會(huì)影響 RNA 的使用。
12. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的 RNase-free 收集管中，加入 30-100 uL RNA 洗脫液，室溫放置兩分鐘。
13. 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為 RNA 樣品，可以立即使用或存放于 -80℃待用。
柱式細(xì)菌RNA-DNA雙提試劑盒14. RNA 完整性的電泳檢測(cè)：如果需要做 Northern 雜交，強(qiáng)烈建議用戶使 用甲醛變性膠進(jìn)行 RNA 電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的 RNA 分子 （BioTechniques，28：414，2000）。
15. RNA 產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定：將 5-10 μL RNA 溶于 TE 緩沖液中(pH7.5-8.2 之 間)檢測(cè)其在 OD260 的光吸收。通過(guò)光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度 X 體 積)和產(chǎn)率(RNA 產(chǎn)量/組織用量)。
16. RNA 純度測(cè)定：無(wú)污染的總 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，高于此范圍則 分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響 RT-PCR 等反應(yīng)。
