醫(yī)院病理科PCR實驗室建設

PCR實驗室原則上為試劑準備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴增區(qū)和擴增產物分析區(qū)四個單獨的工作區(qū)域并設有走廊，各工作區(qū)域應設緩沖間，工作區(qū)與緩沖間宜安裝連鎖裝置。不同功能的工作區(qū)應是分隔獨立的，各工作區(qū)有明顯的標志，不能直通，如果緊密相連，需安裝物品傳遞窗。

前兩區(qū)為擴增前區(qū)，后兩區(qū)為擴增后區(qū)，擴增前區(qū)與擴增后區(qū)應嚴格分開。實驗材料、試劑、記錄紙、筆、清潔材料等，只能從擴增前區(qū)流向擴增后區(qū)，即從試劑準備區(qū)→樣品制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)，不得逆向流動。實驗室的氣流也應從擴增前區(qū)流向擴增后區(qū)，不得逆向流動。各工作區(qū)頂部應安裝紫外燈，紫外燈的波長為254nm，每20㎡一支40W的紫外燈。

1、樣本間交叉污染：

收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。

2、實驗試劑污染：

主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。 加樣過程中，因為 PCR 試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃，但這個過程也是充滿了污染的風險的。

3、擴增產物污染：

大量拷貝的產物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋，這是 PCR 反應中主要zui常見的污染問題。因為 PCR 產物拷貝量大，遠遠高于 PCR 檢測數個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產物污染，就可形成假陽性。

4、克隆質粒污染：

作為陽性質控品的克隆質粒外溢。

按照實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

5、嚴格執(zhí)行各區(qū)功能劃分：

試劑儲存和準備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。

標本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規(guī)范的要求。

擴增區(qū)：cDNA合成、DNA擴增及檢測。

擴增產物分析區(qū)：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。

試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)和擴增區(qū)內的實驗用品，包括移液器等器具應，空氣、物品流向依次為：試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增區(qū)、產物分析區(qū)，不可逆行。

6、清潔的實驗用品：

實驗室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應管等實驗耗材應一次性使用。

7、正確的實驗操作：

實驗應在超凈工作臺內進行，工作臺內應放置PCR的微量離心機、各量程的移液器和其他必須物品。

實驗的過程中選擇合適尺寸的手套并能及時更換，在進出不同實驗區(qū)域或進行模板操作后都應更換實驗服、帽子及手套，以避免不同實驗區(qū)交叉污染。

裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風險；謹慎開啟反應管，防止管內液體濺出或形成氣溶膠導致污染。

吸加試劑和模板的操作應嚴格按照規(guī)范要求進行，遵守“慢吸快打"原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產生的交叉污染。

PCR試劑建議小量分裝，以減少反復凍融、重復取樣次數；多樣本PCR反應時，先配制反應混合液分裝至反應管中，后加入樣本核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實現*閉管操作。

實驗試劑應與樣品和PCR產物分開保存，不應放于同處。

PCR擴增實驗完成后及時將反應管取出，用一次性手套將產物反應管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。

8、規(guī)范的實驗設計：

應遵循實驗室內部質量控制的相關規(guī)定，實驗中設立陽性對照、陰性對照和空白對照，全程質控實驗過程，驗證PCR反應的可靠性，并協助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。

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