適用于釀酒酵母,畢氏酵母,裂殖酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化。產(chǎn)品說明:
1.操作簡單,單溶液制備,除酵母培養(yǎng)的時間外,整個操作只需要 30 余分鐘。
2.制備得到的感受態(tài)細(xì)胞可以 -80℃保存6個月,方便多次使用.免去每次轉(zhuǎn)化都要新鮮制備感受態(tài)細(xì)胞。(暫時未實現(xiàn).建議現(xiàn)制現(xiàn)用)
3.zuigao轉(zhuǎn)化效率可達到 0.2-1x10°個轉(zhuǎn)化子 /ug 質(zhì)粒 DNA。
4.得到的感受態(tài)細(xì)胞可以用各種線性或環(huán)狀酵母穿梭質(zhì)粒 DNA 進行轉(zhuǎn)化,例 如 YIp，YRp，YCp,YEp和 YAC 等。-
5.可以用于酵母雙雜交、定點突變(Site-Directed Mutagenesis)、基因破壞(GeneDisruption)、等位突變基因修復(fù)(Mutant Allele Recoverv)等實驗。(一)酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備:
1.菌種活化。-80℃保存的菌種在固體 YPDA培養(yǎng)基上四區(qū)劃線,在30℃培養(yǎng)2-4天待酵母單菌落長至2 mm 長時,接種。
注:4℃保存2周內(nèi)的酵母平板可以直接進行挑菌復(fù)蘇,保存時間越長,酵母的活性越低;不要使用4℃
保存一個月以上的平板進行實驗。
2.挑取 2mm 酵母單菌落接種到 3 mL 液體 YPDA 培養(yǎng)基中,30℃過夜培養(yǎng)。
3.第二天轉(zhuǎn)接到含有 50 mL 液體 YPDA培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng),待 OD600到 1.0-1.5左右(相當(dāng)
于1x10'細(xì)胞/mL)。冰上放置 15 分鐘
注:(1).可用 4℃保存一個月內(nèi)的的酵母菌培養(yǎng)產(chǎn)物 3mL 接種 50mLVPDA培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，離
心收集細(xì)胞,用于下游實驗。此步可以節(jié)約菌種活化，小搖所需的時間，
(2)。不同菌種對應(yīng)的zuishiOD 值有差異,不同的 OD 會影響最終電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率:如有
必要可以摸索zuishi條件。
4.收集細(xì)胞:4℃3000g，離心5min，去上清。用 50ml的冰冷的滅菌水重懸。建議重復(fù)洗滌一次;
5.用 20 mL 冰冷的溶液A 懸浮、洗滌沉淀:4℃ 3.000 g.離心5min,去上清。
6.沉淀中加入 0.5 mL 冰冷的的溶液B懸浮,既獲得酵母感受態(tài)細(xì)胞。按 50-100uL 分裝于1.5mL 無菌凍存管(可直接用于轉(zhuǎn)化)。
