Caspase-3 Activity Assay Kit (Colorimetric)
Caspase-3活性檢測試劑盒（比色法）
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Caspase-3活性檢測試劑盒（比色法） | MX3225-20T | 20T | 880 |
Caspase-3活性檢測試劑盒（比色法） | MX3225-100T | 100T | 2890 |
產(chǎn)品描述
Caspases（Cysteine-requiringAspartate Proteases）是一個高度保守的半胱an酸蛋白酶家族，特異性識別底物中的天冬氨酸殘基，在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。Caspases以潛在酶原的形式表達，通過自發(fā)蛋白分解機制或經(jīng)其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工處理的方式被活化。人caspases可細分為三大功能組：細胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡啟動（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡執(zhí)行（caspase-3，-6和-7）。
Caspase-2（Caspase 2），也稱為Nedd2、ICH-1，含核定位所依賴的長前肽結(jié)構(gòu)域的一類caspase。一旦凋亡通路被激活，caspase酶原在Asp316位上被切割生成一個14kDa片段和一個32kDa的前肽結(jié)構(gòu)域/大亞基。接下來在Asp152和Asp330被切割，進一步生成18kDa大亞基和12kDa小片段。Caspase-2是應(yīng)對基因毒性應(yīng)激或有絲分裂障礙的核凋亡反應(yīng)物。一旦招募生成含p53誘導(dǎo)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白-PIDD的復(fù)合物，caspase 2被激活。因此，Caspase-2被認為是核啟動caspase，并且在下游的凋亡途徑中需要激活caspase-9和caspase-3。
Caspase-3活性檢測試劑盒（比色法）（Caspase-3 Activity Assay Kit, Colorimetric or Caspase-3 Colorimetric Assay Kit）以偶聯(lián)上發(fā)色基團pNA的caspase-3序列特異性的多肽為底物。當?shù)孜锉籧aspase-3剪切后，發(fā)色基團被釋放出來，進而用酶標儀或分光光度計來測定其吸光值（λ=405nm或400nm）。通過計算OD凋亡誘導(dǎo)組/OD陰性對照組的比值來確定凋亡誘導(dǎo)組caspase-3的活化程度。
本品適用于培養(yǎng)細胞以及新鮮組織的caspase-3活性檢測。
產(chǎn)品包裝
編號 | 組分名稱 | 保存方法 | 貨號（規(guī)格） | |
MX3225-20T | MX3225-100T | |||
MX3225-A | Lysis Buffer裂解緩沖液 | 2-8℃ | 5ml | 20ml |
MX3225-B | 2× Reaction Buffer 2×反應(yīng)緩沖液 | 2-8℃ | 1ml | 5ml |
MX3225-C | Caspase-3 Substrate Caspase-3底物 | -20℃避光 | 100μl | 500μl |
MX3225-D | 0.1M DTT | -20℃避光 | 60μl | 250μl |
保存與運輸方法
保存：-20℃保存，1年有效。開盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-3 Substrate和0.1M DTT需要避光凍存。
運輸：冰袋運輸。
注意事項
1） Caspase-3 Substrate需避光保存和使用。
2） 某些凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的凋亡可能通過caspase-3非依賴的方式進行，此種情況使用本品檢測的caspase-3活性無明顯變化，則，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。
3） 起始細胞數(shù)量需達3~5×106個或新鮮組織量達50~100mg，以保證達到測定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-3的活性與細胞裂解后的蛋白含量有關(guān)，如測定的OD值偏低，可通過增加細胞數(shù)量或組織量的方法來提高蛋白量。
4） 優(yōu)先選擇測定λ=405nm的吸光值；如有困難，再測定λ=400nm的吸光值。
5） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用方法
1.需要的其他試劑和材料
儀器：低溫高速離心機、酶標儀或分光光度計（100μl的比色皿）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）
耗材：1.5ml微量離心管、96孔酶標板（透明）或100μl的比色皿
試劑：PBS、蛋白定量試劑（比如：Bradford法蛋白濃度測定試劑盒）
2.試劑準備
2.1 Lysis Buffer（含DTT）
于實驗前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。
2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）
于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的反應(yīng)工作液。
3.樣本準備
3.1 細胞裂解
a）用合適方法誘導(dǎo)細胞凋亡，同時設(shè)立陰性對照組（不加誘導(dǎo)劑），收集3~5×106個細胞。
b）PBS洗滌細胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上清。
c）往離心的沉淀細胞中加入15~200μl預(yù)冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混勻。
d）置冰上裂解20~60min，其間渦旋振蕩3~4次，每次10s；或凍融2~3次。
e）4℃，10,000rpm離心1min。
f）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，置于冰上待用。
g）取少量上清（1~2μl），用常規(guī)方法（Bradford法）測定蛋白濃度。
3.2 組織裂解
a）取50~100mg組織置于培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入150~200μl預(yù)冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作。
b）將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml預(yù)冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。
c）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，置于冰上待用。
d）取少量上清（1~2μl），用常規(guī)方法（Bradford法）測定蛋白濃度。
4.Caspase-3活性檢測
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