FITC-Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒
產(chǎn)品貨號(hào)：F6012L
產(chǎn)品規(guī)格：100T
儲(chǔ)存條件：
4℃避光冷藏，請(qǐng)勿凍存。有效期見(jiàn)外包裝。
光譜特性：
FITC-Annexin V: Ex/Em = 494/518 nm
PI: Ex/Em = 535/617 nm (with DNA)
產(chǎn)品介紹：
FITC-Annexin V/PI凋亡試劑盒提供了一種快速簡(jiǎn)便的方法，通過(guò)標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞（綠色）和壞死或晚期凋亡的細(xì)胞 （紅色）檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。產(chǎn)品可以使用流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
Annexin V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為 35-36KD 的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可于磷脂酰（PS）選擇性結(jié)合。 磷脂酰（PS）主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷脂 酰外翻到細(xì)胞表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。此時(shí)，使用綠色熒光探針 FITC 標(biāo)記的 Annexin V，即 FITC - Annexin V， 與外翻的磷脂酰（PS）結(jié)合，就可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡直接檢測(cè)到磷脂酰的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特 征。對(duì)于壞死或晚期凋亡的細(xì)胞，由于細(xì)胞完整性已經(jīng)被破壞，FITC - Annexin V 則可以進(jìn)入胞漿與處于磷脂層內(nèi)側(cè)的 PS 結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞的細(xì) 胞核。PI 可以由 488、532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。
使用方法：
1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
空白管：陰性對(duì)照組細(xì)胞，不加FITC-Annexin V/PI。用于調(diào)節(jié)電壓。
單染管：陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞，只加FITC-Annexin V/只加PI。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加FITC-Annexin V/PI。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
2. 收集細(xì)胞：
(1) 對(duì)于懸浮細(xì)胞：
a. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000 rpm離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。 注：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過(guò)程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù) FITC-Annexin V的結(jié)合。
b. 取5×104 -1×105個(gè)重懸的細(xì)胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入100 µL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細(xì)胞。
c. 加入5 µL FITC-Annexin V，輕輕混勻。
d. 加入5 µL PI染色液，輕輕混勻。
e. 室溫 ( 20-25oC ) 避光孵育10 - 15 min。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過(guò)程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
(2) 對(duì)于貼壁細(xì)胞：
a. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量細(xì)胞消化液(不含EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育 至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)時(shí)，吸除細(xì)胞消化液。需避免的過(guò)度消化。 注：對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化步驟很關(guān)鍵。消化時(shí)間如果過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷， 從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死的假陽(yáng)性；消化時(shí)間如果過(guò)長(zhǎng)，同樣易造成細(xì)胞膜損傷而出現(xiàn)細(xì)胞壞死的假陽(yáng)性，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷 脂酰與FITC-Annexin V的結(jié)合從而干擾對(duì)于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。
b. 加入上步中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，把細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000 rpm離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。 注：加入上步中的細(xì)胞培養(yǎng)液非常重要，一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清 可以有效抑制或中和殘留的。殘留的會(huì)消化并降解后續(xù)加入的 FITC-Annexin V，導(dǎo)致染色失敗。
c. 取5×104 -1×105個(gè)重懸的細(xì)胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入100 µL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細(xì)胞。
d. 加入5 µL FITC-Annexin V，輕輕混勻。
e. 加入5 µL PI染色液，輕輕混勻。
f. 室溫 (20-25oC )避光孵育10 - 15 min?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過(guò)程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
3. 結(jié)果分析：
(1) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：
a. 孵育完成后，可直接加入400 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，立即上機(jī)檢測(cè)， FITC-Annexin V 由488 nm激光激 發(fā)，檢測(cè)熒光發(fā)射光譜在530 nm處（FITC 通道），PI通道發(fā)射光譜約在617 nm處。
b. 在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-Annexin V-/PI-）；右下象限為早期凋亡細(xì)胞，為（FITCAnnexin V+/PI-）；右上象限是壞死與晚期凋亡細(xì)胞，為（FITC-Annexin V+/PI+）；左上象限顯示裸核細(xì)胞，為（FITC-Annexin V-/PI+)。
(2) 熒光顯微鏡檢測(cè)：
a. 1000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞，用400 µL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細(xì)胞。將細(xì)胞移至96孔板中沉降片刻或進(jìn)行 細(xì)胞涂片后，置于熒光顯微鏡下觀察。
b. FITC-Annexin V 可用 FITC適用的濾光片，PI可用 Cy3 或者 Texas適用的濾光片。
注意事項(xiàng)：
1. 使用前請(qǐng)將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2. 為降低細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過(guò)程可在冰上操作，但孵育時(shí)間至少延長(zhǎng)至 30 min。
3. 由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過(guò)程，建議樣品在染色后 1 h 之內(nèi)進(jìn)行分析。
4. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。 處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。消化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜 的損傷，PI 攝入過(guò)多；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰與 FITC-Annexin V 的結(jié) 合。消化時(shí)將鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分，利用剩余的少量再消化一段時(shí)間， 待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會(huì)影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合。
5. 貼壁細(xì)胞用消化后，建議在培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約 30 min 后染色，避免假陽(yáng)性。
6. 為了避免洗滌細(xì)胞時(shí)損失細(xì)胞，在吸液時(shí)可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。
7. 染料的使用濃度由具體實(shí)驗(yàn)要求確定。
8. 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，保存和使用過(guò)程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
9. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
