ATP含量試劑盒(酶法)
ATP含量試劑盒(酶法)
本試劑盒僅供科研使用 1 ATP 含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書 (貨號(hào):WS7580F 分光法 48 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介: 三磷酸腺苷(ATP)是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體,是生物體內(nèi)最直接的能量來(lái)源, 測(cè)定 ATP 含量并且計(jì)算能荷,能夠反映能量代謝狀態(tài)。 三磷酸腺苷(ATP)在己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶混合酶的作用下,使 ATP 水解 并伴隨著 NADPH 的生成,通過(guò)檢測(cè) 340nm 下 NADPH 的增加量,進(jìn)而計(jì)算得到 ATP 的 含量。 二、試劑盒的組成和配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下或離心,使粉劑落 入底部,再加 1.1mL 蒸餾水備用。 試劑二 粉劑×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心,使粉劑落 入底部,再加 1.1mL 蒸餾水備用。 試劑三 33mL 液體×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下或離心,使粉劑落 入底部,再加 1.1mL 蒸餾水備用。 三、所需的儀器和用品: 紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿(光徑 1cm)、恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、研缽 和蒸餾水。 四、ATP 含量檢測(cè): 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1、樣本制備: ① 組織樣本: 稱取約 0.1g 組織加入研缽中,加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿,12000rpm,4℃離心 10min,取上清液,置冰上待測(cè)。 【注】:也可以按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例提取 ② 細(xì)菌/真菌樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心棄上清;取 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液; 冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3S,間隔 10S,重復(fù) 30 次);12000rpm,4℃離心 10min,取上清液,置冰上待測(cè)。 【注】:也可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例進(jìn)行提取 ③ 液體樣本:澄清的液體直接檢測(cè);若渾濁則離心后取上清檢測(cè)。 ④ 高蛋白含量樣本: ④-1:稱取約 0.1g 組織加入研缽中,加入 1mL 蒸餾水,進(jìn)行勻漿,轉(zhuǎn)至 EP 管中,于 95℃水浴中煮 5min,取出冷卻至室溫后于 12000rpm,室溫離心 10min,上清液待測(cè)。 ④-2:或稱取約 0.1g 組織加入研缽中,加入 0.5mL 高氯酸(0.5M),進(jìn)行冰浴勻漿, 8000rpm,4℃離心 10min,取全部上清至另一 EP 管中,再加入與上步所取上清液等體 積的 KOH 或 NaOH(0.5M)混勻,使整個(gè)液體 PH 近中性,若澄清直接檢測(cè),若渾濁 則 8000rpm,4℃離心 5min 后取上清液測(cè)定,此時(shí)整個(gè)上清液體積記為 V3。本試劑盒僅供科研使用 2 2、上機(jī)檢測(cè): ① 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340nm,蒸餾水調(diào)零。 ② 在 1mL 石英比色皿(光徑 1cm)中依次加入: 試劑名稱(μL) 測(cè)定管 樣本 40 試劑一 20 試劑二 20 試劑三 600 混勻,室溫(25℃)下,5min后于340nm 處讀取A1值。 試劑四 20 混勻,室溫(25℃)下,反應(yīng)15min于 340nm處讀取A2值,ΔA=A2-A1。 【注】若ΔA 差值在零附近,可增加樣本量 V1(如 100μL,則試劑三相應(yīng)減少)。 則改變后的 V1 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、按樣本鮮重計(jì)算: ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=2.78×ΔA÷W 2、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算: ATP 含量(μmol/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(500×V1÷V)=0.006×ΔA 3、液體中 ATP 含量計(jì)算: ATP 含量(μmol/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷V1=2.78×ΔA 4、高蛋白樣本中 ATP 含量計(jì)算: ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=2.78×ΔA÷W ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V3)=2.78×ΔA÷V3÷W ε---NADPH的摩爾吸光系數(shù)為6.3×103L/mol/cm; d---光徑距離,1cm; V---提取液體積,1mL; V1---樣本體積,40μL=0.04mL; V2---反應(yīng)總體積,700μL=7×10-4L; ATP分子量---551.14; W---樣本質(zhì)量,g。