間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測(cè)抗體之標(biāo)本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標(biāo)記抗抗體，（對(duì)人的標(biāo)本來(lái)說(shuō)即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM），再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色，底物降解的量，即為欲測(cè)抗體的量，其結(jié)果可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定，本法用同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標(biāo)記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲(chóng)病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標(biāo)記抗人IgM，則可用于早期診斷。
1.實(shí)驗(yàn)材料、試劑、儀器
血清 血漿 體液
PBS 包被緩沖液 硫酸 檸檬酸
96孔板 酶標(biāo)比色計(jì) 移液槍 離心管 離心管盒
2.實(shí)驗(yàn)步驟
一、包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至zui適濃度（5～20 μg/ml）各0.3 ml加于微反應(yīng)板每個(gè)凹孔中,4℃過(guò)夜或37℃水浴2～3小時(shí)，貯存冰箱。
二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
三、加被檢標(biāo)本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0. 2ml，37℃，作用1～2小時(shí)。
四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
五、加入酶結(jié)合物：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結(jié)合物0.2 ml 37℃作用1～2小時(shí)。
六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
七、加入0.2 ml底物溶液于每個(gè)凹孔（OPD或OT），室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
八、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
九、觀察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD用492nm）OD值。
3.ELISA影響因素
一、 試驗(yàn)樣品
血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗(yàn)樣品（標(biāo)本）。但應(yīng)注意分離血清時(shí)，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會(huì)使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在保存過(guò)程中抗體的穩(wěn)定性報(bào)導(dǎo)尚不多。但一般認(rèn)為作ELISA血清要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復(fù)凍融。血漿可用肝素毛細(xì)管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
被檢血清或血漿標(biāo)本，可用含保護(hù)性封阻劑（吐溫-20）或稱(chēng)濕潤(rùn)劑的緩沖液來(lái)稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如1%牛血清白蛋白等來(lái)稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進(jìn)行孵育。此種被試標(biāo)本可作一系列稀釋度測(cè)定，也可用一個(gè)稀釋度測(cè)定。對(duì)于作某一個(gè)傳染病的診斷來(lái)說(shuō)，先用一系列稀釋度作一批標(biāo)本測(cè)定，求出對(duì)診斷有意義的一個(gè)稀釋度（即測(cè)定劑量反應(yīng)曲線(xiàn)），然后用一個(gè)稀釋測(cè)定即可。zui適稀釋度和孵育時(shí)間均需從實(shí)踐中摸索出來(lái)，對(duì)一般病原微生物所引起的傳染病的血清學(xué)診斷，以1：200稀釋度測(cè)定比較適當(dāng)，而試驗(yàn)標(biāo)本的（即含抗體）作用時(shí)間一般為室溫或37℃ 1-2小時(shí)。但現(xiàn)在對(duì)有些標(biāo)本（如流腦抗原）測(cè)定時(shí)，僅用37℃ 5分鐘。對(duì)單克隆抗體檢測(cè)也可縮短作用時(shí)間。
二、 洗滌劑與稀釋劑
為了使特異性結(jié)合的抗體量盡可能多，包被微量反應(yīng)板凹孔的抗原應(yīng)該稍微過(guò)量。但在孵育或洗滌過(guò)程中，已吸附的抗原可能有部份會(huì)從固相載體上被洗滌下來(lái)。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會(huì)吸附到原來(lái)包被抗原凹孔的空白處，增加本底顏色，產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng),這是限制ELISA特異性的一個(gè)因素。因此不少學(xué)者在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護(hù)性阻劑來(lái)抑制非特異性蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性吸附作用。已經(jīng)證明牛血清白蛋白（BSA）和吐溫-20有良好的封阻作用。其加入的量BSA為0.5%～1%；吐溫-20為0.05%。（有人曾經(jīng)比較了四種洗滌劑，結(jié)果認(rèn)為蒸餾水加0.05%吐溫-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐溫-20都是良好的）。在一般的洗滌劑和稀釋劑中還加有NaN3防腐，但是用HRP制備酶結(jié)合物時(shí)則不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗滌劑或稀釋劑中雖可改善ELISA的結(jié)果觀察，但由于BSA比較昂貴，又不易得到，故也不是非加不可的。
有人在洗滌劑中加入0.1%白明膠，2%免血清，有利于加強(qiáng)封阻作用。zui近有人報(bào)告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl緩沖液中加入0.05%吐溫-20作洗滌劑，效果很好，被檢血清和酶結(jié)合物的稀釋劑，可與洗滌劑相同，但不需加0.2‰的KCl。
在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應(yīng)，而且還可增加陽(yáng)性標(biāo)本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關(guān)。目前采用的洗滌劑為PH7.4PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無(wú)吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應(yīng)用。（0.5mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀釋劑中，可提高特異性。
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