對于含多個(gè)抗原決定簇的大分子蛋白，使用雙抗體夾心ELISA模式測定相當(dāng)簡便，現(xiàn)有的商品試劑盒基本上都采用此種測定模式。具體測定方法如下：
1．首先以雙抗體之一于碳酸鹽緩沖液中4℃下過夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗體后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
2．加入含待測物的臨床樣本如血清等，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，待測抗原就會(huì)與固相上特異抗體反應(yīng)而吸附于固相上。
3．加入酶標(biāo)記的雙抗體之二，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，在固相上即形成雙抗體與特異抗原的夾心產(chǎn)物。
4．加入酶底物，溫育顯色測定（圖2—1）。
在該測定模式中，有兩步溫育和板孔洗滌步驟，如果將上述測定步驟2和3并為一步，即將待測樣本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入，從而僅有一步溫育和洗板過程，即為通常所說的“一步法”。zui初的雙抗夾心ELISA試劑盒，均采用兩步法。后來，人們?yōu)榱斯?jié)省時(shí)間，簡化操作步驟，試劑生產(chǎn)廠家逐步推出了“一步法”試劑盒。目前在我們的臨床實(shí)驗(yàn)室中，測定大分子抗原如HBsAg、。FP和hCG等，基本上都采用一步法。一步法相比于兩步法，雖然操作簡單‘但有其固有的缺陷，處理不好，對ELISA測定結(jié)果有嚴(yán)重影響。
在通常的兩步溫育洗滌方法中，抗原抗體反應(yīng)將遵循下述規(guī)律，即在*步中加入的待測標(biāo)本中抗原（Ag）濃度逐步增加時(shí)，將使固相抗體（Ab）與抗原的結(jié)合逐步達(dá)到飽和[（1）式]，這樣當(dāng)隨后加入一定濃度的酶標(biāo)抗體（Ab’）后，a復(fù)合物的形成將直接與在*步中形成的b復(fù)合物相關(guān)[（2）式]，因此，待測抗原濃度的逐步增加導(dǎo)致了顯色的逐步加深，當(dāng)抗原濃度增加到一定程度時(shí)，反應(yīng)顯色達(dá)到平臺，而呈S形變化曲線（圖2—2）。
而一步法雙抗夾心ELISA的反應(yīng)曲線則為鐘形曲線（圖2—3）。也就是說測定顯色隨著待則標(biāo)本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的“鉤狀效應(yīng)”（hook eHect），也就是我們在免疫沉淀試驗(yàn)中所稱的“帶現(xiàn)象”（zonephen。menon）。一步法的反應(yīng)平衡式如（3）式
此外，b和c復(fù)合物的增加亦使得“雙抗體夾心復(fù)合物”難以形成。但如果 固相單抗和標(biāo)記單抗采用針對抗原的不同且空間距離較遠(yuǎn)的決定簇的抗體，即包被使用一種 單抗，酶標(biāo)記使用另一種單抗，同時(shí)充分混勻反應(yīng)液，并適當(dāng)延長反應(yīng)溫育時(shí)間，則可使b，。和 d復(fù)合物減少至zui低程度，而大大減輕“鉤狀效應(yīng)”。
我們曾使用本室能得到的含zui高濃度（約2mg／m1）HBsAg的血清樣本對目前國內(nèi)較大的試劑生產(chǎn)廠家的“一步法”HBsAg測定ELISA試劑盒的“鉤狀效應(yīng)”進(jìn)行了評價(jià)，盡管大部分有在HBsAgzui高濃度下的測定顯色較次高濃度（1：lo稀釋）顯色要淺的現(xiàn)象，但均未出現(xiàn)該份樣本測定為陰性的情況。盡管如此，在臨床實(shí)際工作中，仍有可能遇到“鉤狀效應(yīng)”較嚴(yán)重的HBsAg測定ELISA試劑盒，我們也經(jīng)常聽到基層實(shí)驗(yàn)室同行在這方面的反映。因此，大家還應(yīng)該重視這方面的問題·，當(dāng)發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果明顯與臨床不符或與相關(guān)測定指標(biāo)互有矛盾，如 HBeAg陽性樣本HBsAg測定為陰性時(shí)，就應(yīng)考慮HBsAg測定可能存在的“鉤狀效應(yīng)”問題。
綜上所述，一步法ELISA試劑盒作為迎合臨床實(shí)驗(yàn)室簡便快速要求的產(chǎn)物，有著巨大的市場，其雖有潛在缺陷，易導(dǎo)致含高濃度待測物的標(biāo)本檢測為陰性（假陰性），但精心的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對包被和酶標(biāo)記抗體仔細(xì)選擇，*可以將“鉤狀效應(yīng)”出現(xiàn)的可能性降至zui低。此外，建議生產(chǎn)HBsAg，aFP和hCGELISA"一步法”測定試劑盒的廠家，應(yīng)對所產(chǎn)的試劑在出廠前對其“鉤狀效應(yīng)"（hookeffect）進(jìn)行充分的研究，并提醒用戶在使用時(shí)應(yīng)注意之處。
雙抗體夾心法測抗原另一個(gè)所需要注意的是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。我們知道，RF是一種抗變性IgG的自身抗體，主要為19S的IgM類抗體，也可見7S的IgG及IgA類抗體。這種自身抗體的特性是其是能與多種動(dòng)物的變性IgG的Fc部分結(jié)合。因此，如果血清標(biāo)本中含有RF，在雙抗夾心ELISA檢測時(shí)，其即可作為固相抗體和酶標(biāo)抗體（均為IgG）之間的橋接抗原，而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。因此，如果使用抗體的Fab2：或Fab片段作為酶標(biāo)記用抗體，則可避免RF的干擾。
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