新一代測(cè)序技術(shù)在爆炸式發(fā)展的同時(shí)，也衍生出許多其他技術(shù)創(chuàng)新。RNA深度測(cè)序（RNA-Seq）就是其中之一，這項(xiàng)技術(shù)使我們對(duì)細(xì)胞發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制的理解，達(dá)到了的深度和廣度。盡管研究細(xì)胞RNA并不是什么新鮮事，但RNA-Seq的出現(xiàn)大大拓展了轉(zhuǎn)錄組研究的規(guī)模，取得了累累碩果，這些是傳統(tǒng)技術(shù)難以企及的。
轉(zhuǎn)錄組通常是指一個(gè)細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄本，特定發(fā)育階段或生理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄本可以揭示許多寶貴的生物學(xué)信息。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可以對(duì)細(xì)胞/組織的全部/部分轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。例如，分析細(xì)胞的RNA組成并加以注釋（包括編碼和非編碼的轉(zhuǎn)錄本）；檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)（外顯子/內(nèi)含子邊界、轉(zhuǎn)錄啟示位點(diǎn)、剪切模式、基因融合事件等等）；幫助人們定位基因互作網(wǎng)絡(luò)等等。不過目前zui普遍的應(yīng)用是，通過轉(zhuǎn)錄組研究來確定不同條件下轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式的改變，尋找并驗(yàn)證新生物學(xué)指標(biāo)。
芯片
自二十世紀(jì)九十年代中期以來，芯片就是進(jìn)行高通量基因組表達(dá)分析的中堅(jiān)力量。這一過程包括：抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA、擴(kuò)增、熒光標(biāo)記和片斷化。這些cDNA克隆隨后被用于芯片檢測(cè)，芯片上布滿了相應(yīng)的DNA探針。
芯片上的探針可以代表生物整個(gè)基因組或部分基因組，例如外顯子、miRNA或單核苷酸多態(tài)性SNP等等。芯片上各點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)弱，代表了該探針目的基因（蛋白）的表達(dá)量。“這一切以雜交為中心，是一種高靈敏高特異性的途徑。芯片檢測(cè)的結(jié)果很容易釋讀，誤差很小，” 美國(guó)國(guó)家兒童醫(yī)療中心的遺傳醫(yī)學(xué)研究中心主任Eric Hoffman說。
為了尋找影響Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的調(diào)節(jié)子，Hoffman設(shè)計(jì)并訂制了一個(gè)芯片。“我們通過這一芯片，可以專注于分析改變了蛋白質(zhì)的多態(tài)性，從而縮小范圍，使結(jié)果更易于解讀，”他解釋道。
芯片技術(shù)的zui大局限是，構(gòu)建芯片需要已知的基因組信息。對(duì)于基因數(shù)據(jù)庫中沒有的非編碼RNA和未測(cè)序生物的RNA，就無法用芯片技術(shù)來檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄情況?？梢姡酒夹g(shù)并不是探索未知領(lǐng)域的理想工具。此外，芯片檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍較窄，這意味著你往往必須在高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本中做出選擇，而罕見轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)并不容易。除非進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)，一般芯片無法鑒別剪切突變或等位基因特異性突變。而且由于存在交叉反應(yīng)，用芯片法檢測(cè)高度相關(guān)的RNA種類也并不理想。
RNA-Seq
上述問題在RNA-Seq技術(shù)出現(xiàn)后，得到了極大改善。RNA-Seq技術(shù)可對(duì)樣本中所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行多重測(cè)序，不論是否存在參考基因組，都可以獲得到堿基的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組。隨著測(cè)序技術(shù)的成本持續(xù)走低，RNA-Seq正迅速成為研究基因組表達(dá)情況的途徑。該技術(shù)能夠呈現(xiàn)五個(gè)數(shù)量級(jí)的表達(dá)水平差異，還能檢測(cè)外顯子、等位基因突變以及非編碼RNA等等。
不同RNA-Seq平臺(tái)的讀取長(zhǎng)度不同，從36bp到400bp不等。不論是否存在參考基因組，這這些讀段都可以通過軟件定位，重新構(gòu)成全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本。
通過RNA-Seq實(shí)驗(yàn)可以獲得相當(dāng)驚人的數(shù)據(jù)量，而這恰恰是一柄雙刃劍。豐富的數(shù)據(jù)量蘊(yùn)含著大量的寶貴信息，但這樣的數(shù)據(jù)需要進(jìn)行復(fù)雜而耗時(shí)的生物信息學(xué)分析，才能從中提取到有意義的結(jié)果。因此，人們往往會(huì)在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行一些預(yù)處理，以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)釋讀，例如事先挑選或去除poly-A RNA。盡管如此，RNA-Seq所生成的數(shù)據(jù)仍然比芯片要多上幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
“許多RNA測(cè)序研究都在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果釋讀上遇到了麻煩，” Hoffman警告說。“RNA-Seq生成的數(shù)據(jù)量更大，靈敏度更高，動(dòng)態(tài)范圍更廣，但這并不等于你的問題就一定能得到順利解決。”
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