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FFPE樣品制備和分析寶典（二）

閱讀：503發(fā)布時(shí)間：2013-3-26

　　*福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片的存檔代表了珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料。隨著越來越多的研究人員轉(zhuǎn)向FFPE樣品的分子分析，開發(fā)特定的操作步驟，考慮這些樣品的*性質(zhì)就變得越來越重要。二、從FFPE樣品中提取有用分析物的的關(guān)鍵因素
　　
　　從FFPE樣品中純化DNA、RNA和蛋白時(shí)，目前存在一些主要困難。首先，這些生物分子彼此交聯(lián)。交聯(lián)程度和不可逆交聯(lián)的比例取決于，或部分取決于，福爾馬林固定的持續(xù)時(shí)間。其次，核酸常常嚴(yán)重片段化，這取決于FFPE樣品如何制備和保存。第三，由于FFPE樣品很珍貴，故只有有限的材料可用于分析物純化和下游分析。因此，所用的純化步驟必須是的，盡可能多地回收有用的分析物。本章介紹了從FFPE樣品中純化DNA、RNA和蛋白的*挑戰(zhàn)，以及如何zui有效地克服它們。
　　
　　1脫蠟
　　
　　從FFPE樣品中純化核酸和蛋白之前，需要開展脫蠟。在此過程中，先溶解石蠟，然后去除，暴露樣品，用于后續(xù)裂解緩沖液和蛋白酶K（如果合適）的處理。多種溶劑適用于脫蠟，而溶劑的選擇取決于后續(xù)開展的純化步驟。
　　
　　對(duì)于DNA或RNA的純化，包括用蛋白酶K消化樣品，讓核酸與硅膠模結(jié)合，可選擇各種疏水溶劑用于脫蠟。具體包括二甲苯、庚烷和*。對(duì)于FFPE樣品的蛋白純化，如果蛋白用于westernblotting等下游應(yīng)用，二甲苯脫蠟很合適。不過，對(duì)于2D-PAGE等苛刻應(yīng)用，只能使用庚烷，才能確保非常的脫蠟。
　　
　　從FFPE樣品中純化DNA或RNA之前，使用QIAGEN的新型脫蠟溶液，可實(shí)現(xiàn)更為方便的脫蠟。在加入FFPE樣品之后，溶液仍在樣品上，同時(shí)可開展蛋白酶K消化。在加入脫蠟溶液后無需沉淀FFPE樣品，也無需去除包含石蠟的上清。因此避免了脫蠟過程中損失樣品的風(fēng)險(xiǎn)。
　　
　　作為溶劑法的替代，石蠟也可通過加熱與FFPE樣品分離：熔化后，石蠟冷卻，取決于其用量，石蠟粘在管壁上，或在樣品上形成一個(gè)固體層。
　　
　　福爾馬林交聯(lián)限制了生物分子的純化福爾馬林固定對(duì)DNA、RNA和蛋白的影響。福爾馬林固定導(dǎo)致核酸之間、蛋白之間以及核酸和蛋白之間的交聯(lián)。固定時(shí)間越長，交聯(lián)程度越大。
　　
　　2基因組DNA的純化
　　
　　由于FFPE樣品包含的DNA分子會(huì)彼此交聯(lián)，并與RNA和蛋白分子交聯(lián)，故這些交聯(lián)必須斷裂，才能釋放出DNA用于后續(xù)純化。如果可能的話，因交聯(lián)而引起的化學(xué)修飾也應(yīng)當(dāng)逆轉(zhuǎn)，因?yàn)榛瘜W(xué)修飾的DNA不能在純化過程中回收，而且在PCR或其他酶學(xué)分析中是一個(gè)不佳的底物。然而，在斷裂交聯(lián)和逆轉(zhuǎn)化學(xué)修飾時(shí)必須小心，因劇烈的反應(yīng)條件可能導(dǎo)致DNA的進(jìn)一步片段化。
　　
　　QIAamp®DNAFFPETissueKit提供了一個(gè)克服交聯(lián)的有效方法，此試劑盒是特別為FFPE樣品的基因組DNA純化而設(shè)計(jì)的。樣品先用蛋白酶K在56°C處理1小時(shí)，這一步通過消化交聯(lián)蛋白而釋放DNA。接著是優(yōu)化緩沖液中的90°C孵育，這可部分逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：在孵育過程中，氨基之間的亞甲基橋斷裂，且釋放出的甲醛分子與受體分子結(jié)合。
　　
　　盡管過度加熱會(huì)導(dǎo)致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在90°C孵育1小時(shí)可實(shí)現(xiàn)可分析基因組DNA的*回收（圖7和8）。數(shù)據(jù)還顯示，56°C的1小時(shí)孵育加上90°C的1小時(shí)孵育使蛋白酶K過夜孵育不再成為必需?；蚪MDNA的*回收。大鼠肝臟的FFPE切片用蛋白酶K在56°C處理1小時(shí)，之后按圖中所示的條件孵育。作為對(duì)照，一個(gè)樣品與蛋白酶K在56°C孵育過夜。利用QIAampDNAFFPETissueKit純化基因組DNA，并利用分光光度計(jì)確定DNA產(chǎn)量。與80°C孵育和56°C的過夜孵育相比，90°C孵育實(shí)現(xiàn)了DNA的更佳回收。從FFPE組織中回收可用的基因組DNA。大鼠肝臟的FFPE切片用蛋白酶K在56°C處理1小時(shí)，之后按圖中所示的條件孵育。利用QIAampDNAFFPETissueKit純化基因組DNA，并用QuantiTect®SYBRGreenPCRKit和Pmp2基因特異的2對(duì)不同引物開展SYBRGreen®法實(shí)時(shí)定量PCR。生成的擴(kuò)增子為78bp或464bp。90°C孵育產(chǎn)生的CT值比80°C孵育更低：這表明更高溫的90°C孵育在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)上更為有效，提供了更多有用的DNA，供實(shí)時(shí)定量PCR分析之用。作為對(duì)照，一個(gè)樣品與蛋白酶K在56°C孵育過夜。
　　
　　在2步孵育之后，DNA可利用QIAampMinElute®離心柱純化：在硅膠模上分離DNA，洗滌以去除污染，之后以20-100μl的小體積洗脫。另外，當(dāng)DNA與硅膠模結(jié)合之前，也可開展樣品的RNaseA消化。如果DNA的下游應(yīng)用對(duì)RNA污染敏感，則需要這一步。如果純化的DNA需要通過分光光度計(jì)定量，也需要RNaseA消化，因?yàn)镽NA污染也會(huì)貢獻(xiàn)吸光值讀數(shù)，導(dǎo)致DNA產(chǎn)量的過高估計(jì)。為了提高標(biāo)準(zhǔn)化和便利性，QIAampDNAFFPETissueKit所開展的DNA純化必要時(shí)也可在QIAcube®上自動(dòng)開展。
　　
　　盡管*的裂解和孵育條件可從FFPE樣品中釋放DNA，部分逆轉(zhuǎn)甲醛修飾，但對(duì)于純化后DNA的下游分析，仍有一些限制。首先，固定過程中的化學(xué)修飾可能引入不想要的序列變化，降低DNA穩(wěn)定性和酶學(xué)分析的效率，讓A260/A280的純度分析變得困難。其次，由于FFPE樣品中的DNA隨時(shí)間而逐漸片段化，故只能分析短序列（例如在PCR應(yīng)用中，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)產(chǎn)生短擴(kuò)增子的引物）。此外，較短的DNA段可能導(dǎo)致DNA產(chǎn)量的過高估計(jì)，因吸光值讀數(shù)更高。3全基因組擴(kuò)增
　　
　　FFPE樣品的珍貴特性意味著只有少量DNA能夠純化，這限制了我們能夠開展的分子分析的數(shù)量。DNA樣品量的增加可通過全基因組擴(kuò)增（WGA）來實(shí)現(xiàn)，其中整個(gè)基因組是利用一種高度進(jìn)行性的DNA聚合酶擴(kuò)增的。然而，從FFPE樣品中片段化的DNA開始時(shí)，這是一個(gè)挑戰(zhàn)。
　　
　　REPLI-g®FFPEKit采用了一種改進(jìn)的WGA方法，實(shí)現(xiàn)了FFPE樣品中基因組DNA的擴(kuò)增，且不需要預(yù)先的DNA純化。片段化DNA先隨機(jī)連接，形成更高分子量的DNA分子。隨后利用一種高度進(jìn)行性的DNA聚合酶來開展WGA。盡管DNA段未按照正確的順序拼接，但假如分析方法稍作修改，還是能在某些應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)可靠的DNA分析。例如，如果引物設(shè)計(jì)成產(chǎn)生盡可能短的擴(kuò)增子，那么可開展PCR和實(shí)時(shí)定量PCR分析（圖9）。盡管數(shù)據(jù)顯示了358bp片段的成功PCR擴(kuò)增，但我們建議PCR分析的擴(kuò)增子在100bp左右，因?yàn)镕FPE樣品中的DNA嚴(yán)重片段化，且甲醛修飾會(huì)減少可讀取DNA序列的長度。利用FFPE組織中的基因組DNA開展的可靠PCR和實(shí)時(shí)定量PCR。A6個(gè)人肝臟FFPE樣品（11年）經(jīng)過REPLI-gFFPEKit的全基因組擴(kuò)增。產(chǎn)生的DNA樣品隨后用于終點(diǎn)PCR，利用QIAGENFastCyclingPCRKit在Eppendorf®Mastercycler®epgradientS上開展，以擴(kuò)增358bp的序列。1-6：DNA樣品；N：無模板對(duì)照；M：marker。B2個(gè)人肝臟FFPE樣品（11年）經(jīng)過REPLI-gFFPEKit的10次獨(dú)立全基因組擴(kuò)增反應(yīng)。隨后利用QuantiFastSYBRGreenPCRKit和Stratagene®Mx3005P®循環(huán)儀開展實(shí)時(shí)定量PCR，以擴(kuò)增100bp的序列。
　　
　　4亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化
　　
　　表觀遺傳學(xué)DNA甲基化分析中的*步是開展亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，其中未甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化成*。由于甲基化的胞嘧啶不受亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的影響，故可通過PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR來檢測(cè)，或焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing®）來檢測(cè)和定量。然而，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化需要在高溫和低pH值下孵育，因此可能發(fā)生DNA的片段化。在研究來自FFPE樣品的早已嚴(yán)重片段化的DNA時(shí)，這可能是個(gè)問題。
　　
　　EpiTect®PlusFFPEBisulfiteKit具有一些*之處，可實(shí)現(xiàn)FFPE樣品中DNA的*回收，并提供zui大程度的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，而不會(huì)導(dǎo)致DNA進(jìn)一步降解。首先，此試劑盒采用一種優(yōu)化的脫蠟步驟，它能zui大限度地減少操作，節(jié)省時(shí)間，并盡可能提高DNA產(chǎn)量。在脫蠟之后，樣品先用蛋白酶K在56°C處理30分鐘，通過消化交聯(lián)蛋白而釋放DNA。之后在一種新穎的緩沖液中95°C孵育1小時(shí)，以部分逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：在孵育過程中，氨基之間的亞甲基橋斷裂。盡管過度加熱會(huì)導(dǎo)致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在95°C孵育1小時(shí)可實(shí)現(xiàn)基因組DNA的*回收，DNA無需進(jìn)一步純化，可直接用于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化步驟。通過創(chuàng)新的DNA保護(hù)技術(shù)，可防止亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過程中的化學(xué)DNA降解。FFPE樣品中的DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化之后的PCR分析。利用EpiTectPlusFFPEBisulfiteKit或供應(yīng)商Z的同類試劑盒從大鼠FFPE肝臟組織（10μm）中純化DNA。A利用PyroMark®PCRKit開展終點(diǎn)PCR，以檢測(cè)的基因。瓊脂糖凝膠分析表明，利用EpiTectPlusFFPEBisulfiteKit純化得到的模板，比同類試劑盒相比產(chǎn)量更佳且高度一致。B利用QuantiTectSYBRGreenPCRKit開展實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以檢測(cè)GSTP基因的2個(gè)大小不同的擴(kuò)增子（156和279bp）。每個(gè)反應(yīng)在4個(gè)樣品上開展，重復(fù)三次。左邊的擴(kuò)增子曲線表明，利用EpiTectPlusFFPEBisulfiteKit純化得到的模板，兩個(gè)擴(kuò)增子的CT值都較低，且結(jié)果高度重復(fù)。而利用同類試劑盒純化得到的模板，只有156bp片段成功擴(kuò)增，且CT值較高（右）。

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