隨著大家對單細胞轉錄組分析的興趣日益增加，開展單細胞RNA-seq的方法也在不斷涌現(xiàn)。近日，斯坦福大學的研究人員比較了市場上各種單細胞RNA擴增方法，以系統(tǒng)評估單細胞RNA-seq方法的靈敏度和準確性。他們的研究結果發(fā)表在《Nature Methods》在線版上。
目前，整個轉錄組的高通量測序（RNA-seq）已廣泛用于各種組織的基因表達分析。然而，人們開展單細胞轉錄組分析的愿望也越來越強烈，這是因為有些細胞量少珍貴，不足以開展傳統(tǒng)的RNA-seq，也有人希望對異質群體中的細胞亞群開展分析。過去的基因表達“平均值”已不再能滿足人們的需求。
近年來，開展單細胞RNA-seq的各種方法時有報道，但關于這些方法的通量和性能還存在一些問題。比如說，性能主要是通過靈敏度和性來評估的。然而，為了評估測定方法的有效性，還應當評估準確性，即測量值與真實值之間有多接近。
為此，斯坦福大學生物工程系的Stephen R Quake領導的研究小組對102個人類單細胞轉錄組進行了定量的RNA-seq分析。他們采用了三種單細胞RNA擴增方法，分別為SMARTer Ultra Low RNA Kit（Clontech）、TransPlex Kit（Sigma-Aldrich）以及利用C1微流體系統(tǒng)（Fluidigm）進行SMARTer cDNA合成。同時，他們也利用大量總RNA開展傳統(tǒng)的RNA-seq，并通過多重qPCR對同一細胞類型中的40個基因進行獨立定量，來評估單細胞方法的準確性。
由于很難獲得表達水平，研究人員計算了每種細胞的相對表達水平，即相對所有轉錄本中位數(shù)表達的基因表達。所產(chǎn)生的無量綱數(shù)應獨立于測定方法，可直接比較，以確定方法的準確性。他們發(fā)現(xiàn)，對于單細胞方法，qPCR和RNA-seq的表達值相關性良好（r > 0.84），證實了單細胞RNA-seq方法能夠以定量的方式檢測基因表達，與目前的金標準qPCR方法一致。
有趣的是，各種方法之間的相關系數(shù)和線性回歸的斜率不同。相關系數(shù)表示每種方法能夠在多大程度上再現(xiàn)qPCR所測定的表達，而斜率表示一些失真。他們發(fā)現(xiàn)，以納升體積開展樣品制備（C1系統(tǒng)）產(chǎn)生了幾乎為1的回歸斜率，表明準確性zui高。一種可能的解釋是，減小反應室的體積可增大反應物的有效濃度，減少模板與非特異分子之間的競爭，從而減少擴增偏向。
此外，研究人員還直接比較了微升和納升級的樣品制備，發(fā)現(xiàn)對于qPCR和RNA-seq，以納升體積制備的樣品都產(chǎn)生了更少的假陽性。作者認為，與管式的樣品制備相比，C1平臺表現(xiàn)出一些優(yōu)勢，包括假陽性低和偏向小。
作者總結道，他們的結果表明，單細胞RNA-seq可產(chǎn)生與qPCR相當?shù)慕Y果，特別是在以納升反應體積制備樣品時（如微流體裝置C1）。通常在樣品制備過程中引入的偏向減小，而相關性也進一步提高。他們希望，低偏向、高通量的單細胞RNA-seq將讓原代組織的研究變得常規(guī)。（
