細(xì)胞遺傳學(xué)意在確定一個(gè)基因組中與眾不同的結(jié)構(gòu)特征。這說起來容易，做起來難。多年來，研究人員手頭的工具很有限，只有吉姆薩染色、FISH和DNA芯片。新興的DNA測(cè)序技術(shù)將細(xì)胞遺傳學(xué)的分辨率提高到的水平，縮小了分子細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)之間的距離。
然而，測(cè)序，想說愛你不容易。測(cè)序讀長(zhǎng)仍然太短，難以直接回答細(xì)胞遺傳學(xué)的問題。當(dāng)然，新的策略在不斷開發(fā)中。在此，我們展望一下基因組測(cè)序在發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)變異（CV）上的前景，盡管有些區(qū)域目前仍無法解析，但隨著技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，終究會(huì)突破。
吉姆薩染色、核型分析等技術(shù)適合觀察Mb規(guī)模的染色體畸變，如非整倍體和大的重排，這可在顯微鏡下觀察到。利用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)，研究人員可檢測(cè)到低至500 kb的結(jié)構(gòu)差異。
DNA芯片的引入實(shí)現(xiàn)了拷貝數(shù)變異和染色體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)，其分辨率低至5-10 kb。不過它們并不能提供重復(fù)拷貝的位置信息。它們也不能檢測(cè)平衡易位?；蛟S更重要的是，芯片在高度重復(fù)的序列上表現(xiàn)不太好，因而無法分辨異常序列的斷裂點(diǎn)。
我們還有另一個(gè)選擇，新一代測(cè)序（NGS）。據(jù)Illumina公司生殖與優(yōu)生健康的市場(chǎng)部Rich Shippy介紹，NGS可檢測(cè)所有的畸變類型，包括平衡易位、倒位和序列水平的變異。他認(rèn)為，與芯片相比，NGS能更加地定位CNV，達(dá)到近乎單核苷酸的分辨率。
在開展分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析時(shí)，測(cè)序的能力無疑取決于多個(gè)參數(shù)，包括文庫大小、讀長(zhǎng)、測(cè)序深度以及待分析序列的*性。當(dāng)然，它還取決于分析類型。
華盛頓大學(xué)的Evan Eichler教授指出，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到25倍時(shí)，就能可靠地檢測(cè)低至2-3 kb的缺失和重復(fù)，比其他方法至少高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。深度讀取能夠確定拷貝數(shù)，但它不能判斷插入序列或倒位，也不能區(qū)分重復(fù)序列是串聯(lián)還是分散在基因組中。
為了確定重復(fù)的位置，研究人員主要依賴于雙端測(cè)序的方法，它從DNA序列兩端開始測(cè)序，其正向和反向read之間的固定距離就代表插入片段的大小。Eichler解釋道：“你要找的是固定在某一位置的一組read，以及固定在另一位置的一組相反的read。就易位而言，一組可能定位到10號(hào)染色體，而另一組定位到20號(hào)染色體。那么我抓到了斷裂點(diǎn)。”對(duì)于倒位，配對(duì)的read可能位于相反的方向。
研究人員也采取split-read的策略，以尋找那些一個(gè)read能定位到參考基因組，而另一個(gè)read不能定位（因?yàn)樗挥谥嘏艛嗔腰c(diǎn)的另一側(cè)）的序列。隨后算法會(huì)搜索參考基因組，尋找那些未定位read的定位點(diǎn)。這種分析有望檢測(cè)更小的插入和缺失。
另一種方法就是序列組裝，其中read被放在一起，通過合并重疊序列而形成連續(xù)的contig。這通常依賴于de novo和本地組裝算法的組合，因其序列長(zhǎng)且足夠準(zhǔn)確，被認(rèn)為是zui有希望確定任何染色體畸變斷裂點(diǎn)的方法。
Evan Eichler教授指出：“如果與細(xì)胞遺傳學(xué)易位、缺失、重復(fù)或倒位相關(guān)的所有斷裂點(diǎn)都定位在單一序列內(nèi)，那就不會(huì)有什么問題。但許多易位都定位到大的、高度相同的重復(fù)序列中，這也是系統(tǒng)無能為力的地方。我們沒有足夠大的庫，或者說單個(gè)read不夠長(zhǎng)。”
所謂的第三代測(cè)序能提供明顯更長(zhǎng)的read，有望解決這一問題。例如，Pacific Biosciences的試劑帶來了8,500 bp的讀長(zhǎng)，甚至有相當(dāng)一部分read超過30,000 bp。這些read可跨越許多重復(fù)區(qū)域，將它們定位到參考基因組中。
Illumina的Moleculo技術(shù)也提供了一種單體型策略，但不是基于長(zhǎng)的read，而是統(tǒng)計(jì)學(xué)和條形碼。該公司zui近在《Nature Biotechnology》上介紹了這種方法，名為“統(tǒng)計(jì)學(xué)輔助的長(zhǎng)read單體型分析（SLRH）”。利用SLRH，他們能夠?qū)⑷齻€(gè)人類基因組中99%的單核苷酸劃分到長(zhǎng)度為0.2-1 Mb的單體型塊中1。
當(dāng)然，更長(zhǎng)read的zui終目標(biāo)是從頭開始構(gòu)建出一個(gè)基因組。畢竟，這才是分子細(xì)胞遺傳學(xué)家所追求的，基因組結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確描述。Eichler認(rèn)為：“這是此領(lǐng)域的圣杯：如果你拿到一個(gè)基因組，測(cè)序，并無需任何指導(dǎo)將其準(zhǔn)確組裝，那么你就大功告成了。所有的分子細(xì)胞遺傳學(xué)家將失去工作。你會(huì)了解所有的倒位、缺失和重復(fù)。”
這一天可能不會(huì)太遙遠(yuǎn)。在上個(gè)月召開的基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展大會(huì)（AGBT）上，Pacific Biosciences宣布了*只利用PacBio read的de novo人類基因組組裝。利用平均讀長(zhǎng)為7,700 bp的reads，他們組裝了54x的基因組，據(jù)介紹，讀長(zhǎng)將在一年之內(nèi)達(dá)到20,000 bp。當(dāng)這一切實(shí)現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞遺傳學(xué)的答案可能唾手可得。
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