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上海哈靈生物科技有限公司
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公司信息
冰凍切片組織線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑盒說明書
2016-3-15 閱讀(1532)
主要用途
冰凍切片組織線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑是一種旨在通過鈣黃綠素-鈷技術，選擇性地聚集在線粒體內呈現(xiàn)熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到細胞漿的熒光染料，即刻發(fā)生熒光淬滅，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種冰凍組織線粒體（動物、人體、昆蟲等）膜通道孔活性的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，分辨率高，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術背景
線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內外膜成分構成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細胞凋亡或壞死時，線粒體內容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過度進入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM，又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素-乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：*，適宜的分子量622d，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結合性；第三，不是線粒體酶的底物；第四，容易進入細胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM進入細胞后，被細胞內酯酶切離，產生具有極性的熒光性強的鈣黃綠素。鈣黃綠素進入線粒體后，被線粒體俘獲。同時胞漿內的鈣黃綠素受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時開放，鈣黃綠素釋放出來，被鈷離子淬滅。線粒體內鈣黃綠素熒光的變化，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。
產品內容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
中和液（Reagent C） 毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和組織細胞染色的容器
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細胞熒光分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，中和液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升中和液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。
- 準備5片待測的厚為10微米的未經固著處理的冰凍切片
- 置于室溫下，小心加上xx微升預冷的清理液（Reagent A），鋪滿整個切片表面
- 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
- 小心加上xx微升室溫預熱的染色工作液，鋪滿整個切片表面
- 在37℃濕潤培養(yǎng)箱里，孵育30至60分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)）
- 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
- 小心加上xx微升清理液（Reagent A），鋪滿整個切片表面
- 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
- 重復實驗步驟7和8一次
- 放上蓋玻片或封片
- 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察（定性檢測）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強
注意事項
- 本產品為50次操作
- 操作時，避免污染母液
- 操作時，須戴手套
- 建議使用新鮮組織（手術切除后1小時內）制成的冰凍切片
- 染色前，所有試劑溶液，除染色液（Reagent B）外，需37℃預熱
- 建議組織染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
- 孵育時，必須避免光照
- 本產品友好使用于雙重染色或重疊染色
- 如果不具備505nm散發(fā)波長的濾波器，可以使用505nm至530nm中的任一波長
- 本公司提供膜通道孔抑制劑： 0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－12226，維護熒光完整
- 本公司提供系列線粒體分析試劑產品
質量標準
- 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
- 本產品經鑒定熒光清晰
