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ELISA試劑盒檢測方法的起源和原理
2018-4-8 閱讀(1831)
酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（elisa試劑盒檢測方法）是20世紀60年代末期發(fā)展起來的一種免疫學(xué)檢測方法，是目前zui廣泛應(yīng)用的標(biāo)記免疫技術(shù)。1966年Nakene和Pierce共同發(fā)表了《酶標(biāo)抗體：制備和抗原定位中的應(yīng)用》，首先提出了酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA試劑盒檢測方法）的基本原理。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表《ELISA KIT方法吸附試驗測定IgG含量》一文，使酶聯(lián)免疫（ELISA試劑盒檢測）技術(shù)成為一種實用的檢測液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的方法。目前酶聯(lián)免疫（ELISA試劑盒）檢測技術(shù)已廣泛用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)等。由于其具有靈敏度高、試劑穩(wěn)定、設(shè)備簡單、操作安全等優(yōu)點，近幾年也將其應(yīng)用到食品領(lǐng)域中來檢測某些食品中的生理活性物質(zhì)。
一、基本概念
1、免疫：籠統(tǒng)地概括起來，免疫就是人和動物機體防御、排除外來物質(zhì)（異物）進人體內(nèi)，同時識別和清除體內(nèi)死亡、變性物質(zhì)和平定體內(nèi)叛亂分子突變細胞，以保護和穩(wěn)定自身的防護機制。
2、抗原：抗原是指那些能夠誘導(dǎo)機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體和致敏效應(yīng)淋巴細胞，并在體內(nèi)外與之特異性結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。
3、抗體：是能與相應(yīng)的抗原專一性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，和機體其他生物大分子一樣是細胞的產(chǎn)物，分泌到體液中或表現(xiàn)在細胞表面上。
4、抗原、抗體反應(yīng)：抗原和抗體在體外的反應(yīng)亦稱血清學(xué)反應(yīng)。這類反應(yīng)可借助免疫學(xué)方法進行檢測。
二、抗體定量檢測方法及其原理
定量分析抗體的常用方法有擴散法、酶聯(lián)免疫吸附法和火箭免疫電泳法等。
1、免疫擴散法
a、單向免疫擴散法
原理：將待檢抗原滴加于含相應(yīng)抗體的瓊脂板小孔中，經(jīng)一定時間擴散后。形成乳白色的沉淀壞，在一定濃度范圍內(nèi)，抗原的含量與沉淀壞直徑成正比?？梢韵扔眉褐煌瑵舛鹊臉?biāo)準抗原制成標(biāo)準曲線，再根據(jù)測試樣品沉淀環(huán)直徑的大小，從標(biāo)準曲線上查出樣品中抗原的相應(yīng)含量。
b、雙向免疫擴散法
原理：可溶性抗原與已知可溶性抗體分別加入相鄰的瓊脂糖凝膠板上的小孔內(nèi)，在電解質(zhì)存在下讓它們相互向?qū)Ψ綌U散。當(dāng)兩者在zui適當(dāng)比例處相遇時，即形成一條清晰的沉淀線。根據(jù)稀釋度與已知標(biāo)準品稀釋度之比，可計算出抗體含量。
2、火箭免疫電泳法
原理：抗原在電場力的作用下向前移動，當(dāng)抗原在通過含有一定量單一抗體的瓊脂凝膠時，即形成抗原抗體復(fù)合物，比例合適即沉淀下來。因抗體遷移率低，而抗原隨電泳向前移動，因而使抗原、抗體形成圓錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，峰的高度與抗原的濃度呈正比。
3、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）
原理：ELISA可用于測定抗體，也可用于檢測杭原。其基本原理是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。3種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）； ②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）； ③酶作用的底物（顯色劑）。
ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體, 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體，生成抗原--待測抗體--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。
根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有以下三種類型的常用方法：
a、間接法
此法是測定抗體zui常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體。加人待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗體）與之結(jié)合。洗滌后，加人酶標(biāo)抗球蛋白抗體（酶標(biāo)抗抗體）和底物進行測定。
b、雙抗體夾心法
此法常用于測定抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加人待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗原）與之結(jié)合。溫育后洗滌，加人酶標(biāo)板中。
c、競爭法
此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體。加入待測抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原，使二者竟?fàn)幣c固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，zui后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負相關(guān)。
