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細(xì)胞彈性蛋白含量比色法（TPPS）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞彈性蛋白含量比色法（TPPS）定量檢測試劑是一種旨在通過酸性加熱萃取并轉(zhuǎn)化為可溶性彈性蛋白，與四苯基卟吩四磺酸染料結(jié)合，在堿性條件下，釋放棕紅色染料，酸性處理后，由分光光度儀比色分析，定量檢測細(xì)胞樣品中彈性蛋白含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的?？梢杂糜跈z測各種彈性蛋白，包括原彈性蛋白（tropoelastin）、致山黧豆中毒彈性蛋白（lathyrogenic）、α彈性蛋白、k-彈性蛋白等。適用于各種細(xì)胞（動物、人體等）或培養(yǎng)上清彈性蛋白水平檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測準(zhǔn)確。

技術(shù)背景

彈性蛋白（elastin）是一種不溶性的非極性的堿性蛋白，具有高度抗拉能力（tensile strength），存在于大動脈、氣管、支氣管、韌帶等結(jié)締組織細(xì)胞間。彈性蛋白由多肽二價交聯(lián)隨機(jī)扭絞（randomly kinked）組成，通過鎖鏈素（desmosine）和異鎖鏈素（isodesmosine）相連。動物細(xì)胞上的原彈性蛋白（tropoelastin）為單體，可溶性，分子量為62至72Kd。與微纖絲（microfibril）糖蛋白結(jié)合，形成彈性基質(zhì)（matrix）或彈性組織筏（raft），構(gòu)成細(xì)胞膜表面。通過酸性加熱萃取彈性蛋白，并轉(zhuǎn)化為可溶性衍生物，α彈性蛋白、k-彈性蛋白等，進(jìn)而使用四苯基卟吩四磺酸（5,10,15,20-tetraphenyl porphin-21H,23H- tetra-sulfonate；TPPS）染料與彈性蛋白發(fā)生溫克爾曼反應(yīng)（Winkelman reaction）結(jié)合，然后在堿性條件下 釋放出棕紅色染料，酸性處理后，呈現(xiàn)綠色，通過分光光度儀（445nm波長）測定，分析彈性蛋白的含量。

產(chǎn)品內(nèi)容

萃取液（Reagent A）          毫升

沉淀液（Reagent B）     毫升

清理液（Reagent C）     毫升

染色液（Reagent D）     毫升

濃縮液（Reagent E）     毫升

解離液（Reagent F）     毫升

強(qiáng)化液（Reagent G）     毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）     毫升

稀釋液（Reagent I）     毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent D）避免光照；試劑具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)液配制和樣品制備的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

平式搖蕩儀：用于樣品操作

干式恒溫儀：用于樣品孵育

微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品預(yù)處理  

1）細(xì)胞上清處理

• 移取300微升細(xì)胞培養(yǎng)上清到1.5毫升離心管
• 加入xx微升萃取液（Reagent A）
• 渦旋振蕩15秒
• 放進(jìn)100℃干式恒溫儀孵育60分鐘
• 置于室溫下15分鐘冷卻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取400微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升4℃預(yù)冷的沉淀液（Reagent B）
• 在冰槽里孵育30分鐘，期間每隔10分鐘渦旋振蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，確保無液體殘留；沉淀顆粒透明且肉眼難以看見
• 置于冰槽里備用

2）細(xì)胞處理

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心抽去培養(yǎng)液
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent C），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液，但保留300微升，混勻細(xì)胞顆粒群
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 加入xx微升萃取液（Reagent A）
• 渦旋振蕩15秒
• 放進(jìn)100℃干式恒溫儀孵育60分鐘
• 置于室溫下15分鐘冷卻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取400微升上清液到新的1.5毫升離心管（注意：上清液可能會呈現(xiàn)黃色）
• 加入xx微升4℃預(yù)冷的沉淀液（Reagent B）
• 在冰槽里孵育30分鐘，期間每隔10分鐘渦旋振蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液（注意：確保無液體殘留；沉淀顆粒透明且肉眼難以看見）
• 置于冰槽里備用

二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

• 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至4號管
• 分別加入xx微升稀釋液（Reagent I）到1至4號管
• 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號管，混勻
• 小心抽去xx微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）
• 將1至4號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

• 分別加入xx微升4℃預(yù)冷的沉淀液（Reagent B）到上述標(biāo)準(zhǔn)管里
• 在冰槽里孵育30分鐘，期間每隔10分鐘渦旋振蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液（注意：確保無液體殘留；沉淀顆粒透明且肉眼難以看見）
• 置于冰槽里備用

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

• 分別加入xx微升染色液（Reagent D）到上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）里（注意：用槍頭抽打使沉淀顆粒溶解）
• 分別加入xx微升濃縮液（Reagent E）
• 渦旋振蕩混勻
• 室溫下，孵育60分鐘，期間每隔15分鐘渦旋振蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液（注意：確保沒有液體殘留）
• 加入xx微升解離液（Reagent F）
• 用槍頭抽打使沉淀顆粒溶解，并輔以渦旋震蕩（注意：確保充分溶解）
• 加入xx微升強(qiáng)化液（Reagent G），混勻（注意：呈現(xiàn)綠色）
• 轉(zhuǎn)移到新的200微升1厘米光徑的比色皿或96孔板
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測（波長445nm）：獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實驗步驟1至11四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)彈性蛋白含量（微克）（注意：標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光讀數(shù)—背景讀數(shù)）

• 樣品測定

• 加入xx微升染色液（Reagent D）到上述配制的待測樣品管里（注意：用槍頭抽打使沉淀顆粒溶解）
• 分別加入xx微升濃縮液（Reagent E）
• 渦旋振蕩混勻
• 室溫下，孵育60分鐘，期間每隔15分鐘渦旋振蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液（注意：確保沒有液體殘留）
• 加入xx微升解離液（Reagent F）
• 用槍頭抽打使沉淀顆粒溶解，并輔以渦旋震蕩（注意：確保充分溶解）
• 加入xx微升強(qiáng)化液（Reagent G），混勻（注意：呈現(xiàn)綠色）
• 轉(zhuǎn)移到新的200微升1厘米光徑的比色皿或96孔板
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測（波長445nm）：獲得樣品吸光讀數(shù)
• 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)彈性蛋白含量（微克）（注意：待測樣品吸光讀數(shù)—背景讀數(shù)）

• 濃度計算

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品
• 本產(chǎn)品檢測范圍為5至100微克彈性蛋白
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作時，標(biāo)準(zhǔn)樣品測定只需1次
• 彈性蛋白沉淀顆粒微小透明，肉眼難以看見
• 操作需要非常細(xì)致，包括避免液體殘留、顆粒溶解等，否則會產(chǎn)生誤差
• 試劑具有腐蝕性，嚴(yán)格注意操作安全
• 孵育時，避免光照
• 如果樣品彈性蛋白含量過低，可以濃縮樣品或增加樣品量
• 樣品濃度可以表述為：微克彈性蛋白/細(xì)胞量；微克彈性蛋白/細(xì)胞總蛋白等
• 通常1 X 10⁵細(xì)胞含有40微克彈性蛋白
• 本公司提供系列彈性蛋白檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感