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主要用途

純化線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑是一種旨在通過鈣黃綠素載入后離心處理或鈷淬滅技術(shù)，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到線粒體外的熒光染料，即刻發(fā)生熒光去除或淬滅，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種純化線粒體膜通道孔活性（瞬時或開放狀態(tài)）的檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，分辨率高，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM，又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：*，適宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結(jié)合性；第三，不是線粒體酶的底物；第四，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM進(jìn)入線粒體后，被內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生具有極性的熒光性強的鈣黃綠素，被線粒體俘獲。同時線粒體外的鈣黃綠素通過離心去除或受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時開放，鈣黃綠素釋放出線粒體外，由于離心處理或被鈷離子淬滅。線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獾淖兓?，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。

產(chǎn)品內(nèi)容

染色液（Reagent A） 微升

中和液（Reagent B） 毫升

保存液（Reagent C） 毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

黑色96孔板：用于線粒體熒光分析的容器

1.5毫升離心管：用于線粒體染色的容器

載波片/蓋玻片：用于線粒體樣品存放后熒光分析

微型臺式離心機：用于沉淀線粒體

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于線粒體熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于線粒體熒光定量分析

實驗步驟

• 直接法

• 準(zhǔn)備好待測的純化線粒體樣品
• 移取100微升線粒體樣品（總量為0.2毫克）到1.5毫升離心管
• 加入xx微升染色液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent C），混勻顆粒群
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去保存液（Reagent C）
• 小心加入xx微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent C），混勻顆粒群
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A）使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述懸液到載波片上，蓋上蓋玻片 

2）激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――

綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：

1）移取100微升上述懸液到100微升比色杯或黑色96孔板

2）即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――

RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 間接法

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，中和液（Reagent B）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升中和液（Reagent B），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好待測的純化線粒體樣品
• 移取100微升線粒體樣品（總量為0.2毫克）到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升含有染色液（Reagent A）和中和液（Reagent B）的染色工作液，充分混勻 
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

• 使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片（每隔5分鐘檢測一次，持續(xù)30分鐘）

2）激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：

1） 移取100微升上述懸液到100微升比色杯或黑色96孔板

2） 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀（每隔5分鐘檢測一次，持續(xù)30分鐘）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強