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北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司

細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù) 研究

時間:2013-9-29閱讀:99
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組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法(histochemical and cytochemical staining method)用于對某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。
(一)固定
物理固定:血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。
化學(xué)固定:如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定,顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。
(二)顯示方法
金屬沉淀法:如磷酸酶分解磷酸酯底物后,反應(yīng)產(chǎn)物zui終生成CoS或PbS有色沉淀,而顯示出酶活性。
Schiff反應(yīng):細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸(Feulgen反應(yīng))。
聯(lián)苯胺反應(yīng):過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧,后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán),進(jìn)而變成棕色化合物。
脂溶染色法:借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。
茚三酮反應(yīng):顯示蛋白質(zhì)。
二、免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry
概念:根據(jù)免疫學(xué)原理,利用抗體同特定抗原專一結(jié)合,對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。
免疫熒光法(immunofluorescent technique):常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。
酶標(biāo)免疫法(enzyme-labeled antibody method):常用的酶有辣根過氧化物酶,酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物,從而顯示出抗原存在的部位。
三、顯微光譜分析技術(shù)
細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜,核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。
可利用顯微分光光度計對某些成分進(jìn)行定位、定性和定量測定。
四、放射自顯影術(shù)
用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。
原理:將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi),經(jīng)過一段時間后,制取切片,涂上鹵化銀乳膠,經(jīng)放射性曝光,使乳膠感光。
一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA,用3H-UDR顯示RNA;用3H氨基酸研究蛋白質(zhì),用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。
14C半衰期為5730年,3H為12.5年。
五、分子雜交技術(shù)
具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段,在適當(dāng)條件下,通過氫鍵結(jié)合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。
(一)原位雜交(in situ hybridization)。
用于檢測染色體上的特殊DNA序列。zui初是使用帶放射性的DNA探針,后來又發(fā)明了免疫探針法。
(二)Southern雜交
是體外分析特異DNA序列的方法,操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DN段,經(jīng)凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上,再用探針雜交,通過放射自顯影,即可辨認(rèn)出與探針互補的特殊核苷序列。
將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上,用探針雜交,則稱為Northern雜交。
六、PCR 技術(shù)
PCR即:polymerase chain reaction。
反應(yīng)體系:①樣品DNA;②引物(primer),約15-20個核苷酸;③4種dNTP;④Tag DNA聚合酶,來自于嗜熱水生菌Thermus aquaticus,zui適作用溫度75~80℃,短時間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。
反應(yīng)過程:①變性:約90-95℃;②復(fù)性:約60℃左右;③延伸:70-75℃;④重復(fù) “變性——復(fù)性——延伸” 過程20-30次循環(huán)。

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