北京低* 高品質(zhì) * HiSpeed Plasmid Maxi Kit （10）
EndoFree Plasmid Giga Kit將高效的內(nèi)毒素去除步驟整合到質(zhì)粒純化流程中，不需要額外步驟，也不需用親和柱去除脂多糖。通過QIAfilter Mega-Giga Cartridge過濾細菌裂解液，并使用重力流QIAGEN-tip 10000陰離子交換柱純化質(zhì)粒DNA。2.5升培養(yǎng)菌液zui多可純化10 mg DNA。純化的DNA無內(nèi)毒素（<0.1 EU/µg DNA）。
選用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit純化低拷貝質(zhì)粒和科斯質(zhì)粒，將會得到更好的效果，因為后者需要較大的培養(yǎng)體積，而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。
EndoFree Plasmid Kits去除細菌在裂解過程中釋放的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素會影響原代細胞和敏感培養(yǎng)細胞的DNA轉(zhuǎn)染。從EndoFree Plasmid Kits得到的無內(nèi)毒素DNA高度適用于可重復且結(jié)果可靠的轉(zhuǎn)染（參見Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency及表"Endotoxin levels in plasmid preparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells"）。QIAGEN超純無內(nèi)毒素DNA也適用于基因治療研究和其他敏感應用。
| 質(zhì)粒制備方法 | 內(nèi)毒素（EU†/µg DNA） | 平均轉(zhuǎn)染效率‡ |
|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Kit | 0.1 | 154% |
| QIAGEN Plasmid Kit | 9.3 | * |
| 2x CsCl | 2.6 | 99% |
| Silica-gel slurry | 1230.0 | 24% |
| DNA純化方法 | 轉(zhuǎn)染細胞比例 |
|---|---|
| EndoFree Plasmid Kit | 21.0% ± 0.93 |
| QIAGEN Plasmid Kit | 8.1% ± 0.57 |
| Silica-gel slurry | 5.2% ± 0.74 |
純化的質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素污染水平取決于所用的純化方法（參見"Endotoxin levels in plasmid preparations"）。硅膠技術(shù)純化的DNA具有非常高的內(nèi)毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和兩次CsCl超速離心可獲得相對低水平內(nèi)毒素的純DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的內(nèi)毒素去除步驟，獲得<0.1 EU/µg的質(zhì)粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊設(shè)計的過濾裝置，用于代替細菌細胞堿裂解后的離心步驟。QIAfilter Cartridges可*去除SDS沉淀，清除細菌裂解液，相比離心可大量節(jié)約時間，減少1小時的質(zhì)粒純化時間。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用內(nèi)部真空方式輕松高效的清除大量細菌裂解液（注意：該試劑盒不包含瓶子）。
QIAGEN-tips中*的陰離子交換樹脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）專為核酸純化而開發(fā)。它的分離性能使得DNA純度與連續(xù)兩次CsCl梯度離心獲得的DNA純度相當。由重力流驅(qū)動并持續(xù)運轉(zhuǎn)的預裝QIAGEN-tips，zui大限度減少手動制備質(zhì)粒所需的時間。整個QIAGEN質(zhì)粒純化系統(tǒng)不使用有毒物質(zhì)，如*，氯仿，溴化乙錠和CsCl，zui大限度地減少對用戶和環(huán)境的危害。內(nèi)毒素，又稱脂多糖或LPS，是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細胞膜的組成部分，如大腸桿菌（參見Bacterial cell wall）。內(nèi)毒素在質(zhì)粒裂解純化過程中釋放出來，并顯著降低內(nèi)毒素敏感細胞株的轉(zhuǎn)染效率（參見Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency及表"Endotoxin levels in plasmid preparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells"）。此外，內(nèi)毒素與DNA競爭“自由”轉(zhuǎn)染試劑，影響轉(zhuǎn)染實驗中質(zhì)粒DNA的攝取。內(nèi)毒素也誘導巨噬細胞和B細胞等免疫細胞發(fā)生非特異性免疫反應，從而導致轉(zhuǎn)染結(jié)果的誤讀。這些反應包括誘導的蛋白質(zhì)和脂類，如IL-1和前列腺素等的合成?？傮w而言，內(nèi)毒素在轉(zhuǎn)染實驗中是不可控變量，影響結(jié)果的可重復性，使它們難以對比、解讀。在基因治療研究中，內(nèi)毒素可造成內(nèi)毒素休克綜合癥和激活補體級聯(lián)，干擾研究。
在堿性條件下，細菌細胞裂解，使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。將Endotoxin Removal Buffer加入到過濾后的裂解液中。冰浴后，將純凈的裂解物上樣到陰離子交換柱上，在適當?shù)牡望}和pH條件下，質(zhì)粒DNA選擇性結(jié)合。用中鹽緩沖液清除RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他低分子量雜質(zhì)，超純質(zhì)粒DNA被高鹽緩沖液洗脫（參見QIAGEN Plasmid Kit procedures）。zui后DNA由異丙醇脫鹽、沉淀并且離心回收。
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