1、材料：
生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO（Sigma D-2650）、無菌塑料冷凍保存管（Nalgene 5000-0020）、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球計數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機（KRYO10SeriesII）。
2、冷凍保存方法：
（1）傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
3、步驟：
（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。
（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5～10％，混合均勻，置于室溫下待用。
（3）依細胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液（約0.1ml）計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。
（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
③adherent tumor lines：5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
（5）冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
