北京松信宏澤科技有限公司

：潘女士

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喹乙醇代謝物ELISA試劑盒

1 概要

喹乙醇 是一類抗毒素，因價(jià)格低廉療效佳，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中，但由于喹乙醇抗菌劑及其代謝物在動(dòng)物源性食品中的殘留可以通過(guò)食物鏈傳給人類，長(zhǎng)期攝入會(huì)引起各種疾病，對(duì)人體有致癌、致畸胎等副作用。

喹乙醇抗菌劑在生物體內(nèi)很快被代謝，代謝物與蛋白質(zhì)結(jié)合后能穩(wěn)定存留一段時(shí)間，所以檢測(cè)喹乙醇?xì)埩魰r(shí)通常是檢測(cè)其代謝物。

目前普遍利用LC-UV、LC-MS、LC-MS/MS進(jìn)行MQCA的殘留檢測(cè)，相對(duì)于高成本的儀器分析，酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）可提供經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、低成本且大量初篩的檢測(cè)。本公司研發(fā)的MQCA酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒，經(jīng)衍生，萃取，ELISA分析即可完成檢測(cè)。本試劑盒可用于定性、定量檢測(cè)組織中MQCA的殘留。

2 原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)樣品中的MQCA殘留。在微孔板上預(yù)包被抗MQCA抗原，抗體以及酶標(biāo)二抗競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔板中MQCA抗原以及標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的抗原，洗滌后用H2O2-TMB底物系統(tǒng)顯色，樣品吸光度值與其所含MQCA量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出MQCA含量。

3 試劑盒組份

每個(gè)試劑盒中的試劑可進(jìn)行96個(gè)測(cè)量（包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定），試劑盒組份：                                                                       

包被有MQCA抗原微孔板--------------------96孔（8孔/條×12條）

MQCA標(biāo)準(zhǔn)品溶液---------------------------------------6瓶（1mL/瓶）

0號(hào)：0 μg/L；1號(hào)：0.5μg/L；2號(hào)：1.5μg/L；3號(hào)：4.5 μg/L；4號(hào)：13.5 μg/L；5號(hào)：40.5μg/L

抗體工作液---------------------------------------------------1瓶（7 mL）

酶標(biāo)二抗工作液---------------------------------------------1瓶（7 mL）

底物溶液 A--------------------------------------------------1瓶（7 mL）

底物溶液 B--------------------------------------------------1瓶（7 mL）

終止液---------------------------------------------------------1瓶（7 mL）

20×濃縮洗滌------------------------------------------------1瓶（40 mL）

2×濃縮復(fù)溶液----------------------------------------------1瓶（40 mL）

封板膜-------------------------------------------------------------------1張

說(shuō)明書-------------------------------------------------------------------1份

4 另外所需儀器和試劑

4.1試劑

l 5 M NaOH：準(zhǔn)確稱取20 g NaOH（分析純）, 加入去離子水（或蒸餾水）定容至100mL。

l 0.1 M HCl：準(zhǔn)確吸取0.86 ml 濃鹽酸，加入去離子水（或蒸餾水），定容至100 ml。

l 2 M硫酸：將濃硫酸與去離子水（或蒸餾水）按照體積比1:8稀釋代用（80 mL水+10 mL濃硫酸）

l 1×復(fù)溶液：取1份 2×復(fù)溶液和去離子水（或蒸餾水）按照體積比1: 1充分混合均勻待用

l 提取液：取100 mL 0.1 M鹽酸，加入2.5 g NaCL,混合均勻，然后取出10 mL混合均勻的溶液與10 mL甲醇混合均勻待用

l 乙酸yi酯（分析純）

l 正己烷（分析純）

4.2儀器

l 微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）

l 恒溫箱（37℃）

l 天平（精度0.01 g）

l 均質(zhì)機(jī)

l 振蕩器

l 離心機(jī)和離心管

l 水浴鍋

l 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或氮吹儀

l 可調(diào)式0.5 μL～20 μL， 20 μL～200 μL 和100 μL～1000 μL 微量移液器

l 多道移液器

喹乙醇代謝物ELISA試劑盒

5 樣品處理

組織方法一（稀釋倍數(shù)為2倍）

l 取勻質(zhì)的樣品1.0 g（組織肉類應(yīng)確保樣本無(wú)明顯的塊狀的組織）于50 mL離心管中，加入8mL乙酸yi酯，再加入1 mL蒸餾水，1 mL 2 M 硫酸，充分震蕩混勻2分鐘

l 室溫（20～25℃）下4000 rpm離心10分鐘，取上清液4 mL于另一只10 mL離心管中。

l 56~60℃環(huán)境下，氮?dú)獯蹈?nbsp;（氮吹時(shí)，使用流量為6 L/ min，一般吹20分鐘即可）。

l 加入1mL正己烷，渦旋1分鐘。加入1 mL1×復(fù)溶液渦旋1分鐘，室溫下4000 rpm離心10分鐘。棄上層有機(jī)相，取下清液50 μL用于分析。

組織方法二（稀釋倍數(shù)為2倍）

l 取勻質(zhì)的樣品1.0 g（組織肉類應(yīng)確保樣本無(wú)明顯的塊狀的組織）于50 mL離心管中，加入4 mL提取液， 充分震蕩混勻5分鐘

l 取上清1 mL加入5~10 μL5 M NaOH 調(diào)節(jié)PH在7.4左右

l 取50 μL用于分析。

6 注意事項(xiàng)

l 乙酸yi酯層一般20分鐘即可吹干，若仍然有有機(jī)溶劑殘存，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)氮吹時(shí)間，盡量去除有機(jī)溶劑。

l 由于正己烷對(duì)有機(jī)類容器，如塑料離心管，有侵蝕作用，吹干乙酸yi酯層步驟應(yīng)盡量使用玻璃試管，或一次性聚苯乙烯或聚丙烯試管，以免侵蝕作用產(chǎn)生的雜質(zhì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

l 由于槍頭和乙酸yi酯有一定的浸潤(rùn)作用，使得實(shí)際吸取量大于要求量，可能會(huì)造成添加回收實(shí)驗(yàn)的回收率稍有偏高的現(xiàn)象。因此在吸取時(shí)注意吸取量要控制準(zhǔn)確。

l 標(biāo)準(zhǔn)品中含有高濃度的MQCA，請(qǐng)小心使用，避免污染試劑盒以及檢測(cè)樣本。

l 嚴(yán)格按照說(shuō)明書的相應(yīng)說(shuō)明來(lái)保存和使用試劑盒內(nèi)的各種試劑。

l ELISA盡量保持在室溫環(huán)境下操作，以避免因溫度差異帶來(lái)的變異；同時(shí)避免在通風(fēng)口和陽(yáng)光直射下操作。

l 試劑盒試劑稀釋以及樣本提取確保使用蒸餾水或去離子水；有機(jī)溶劑在有效期內(nèi)使用，各項(xiàng)指標(biāo)應(yīng)符合分析純標(biāo)示。

l 確保樣本正確儲(chǔ)存(測(cè)試樣本在2~8℃下冷藏盡量不超過(guò)1天，其余分裝-20℃凍存)。

l 試劑使用之前應(yīng)充分混勻，以保證試劑的使用濃度合理。

l 不要使用過(guò)期的試劑盒。

l 不同批次的酶標(biāo)抗原和抗體微孔板不能混用。

l 試劑盒保存于2～8 °C，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔袋密封后2～8 °C存放，底物溶液要避光保存。

l 使用之前，將樣本及所需試劑的溫度平衡至20～25°C，否則可能導(dǎo)致后面檢測(cè)吸光值偏低。試劑使用完后應(yīng)立即放回2～8°C冷藏。

l 洗板后出現(xiàn)板孔干燥，會(huì)導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不好，因此洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

l 反應(yīng)終止液為2 M硫酸，應(yīng)避免與皮膚和衣物接觸。

l 底物溶液如果變藍(lán)表示已經(jīng)變質(zhì)，不能使用。

l 零標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值<0.6時(shí)，表示試劑盒已經(jīng)變質(zhì)，不能使用。

7 檢測(cè)步驟

l 1×洗滌液的配制：將10×洗滌液與去離子水（或蒸餾水）按照體積比1:9比例充分混合均勻待用

l 編號(hào)：將MQCA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，建議每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品均做重復(fù)孔。

l 加樣：每孔加入MQCA標(biāo)品或樣品50 μL，加入50 μL酶標(biāo)二抗工作液50 μL，再加入50 μL抗體工作液。

l 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后室溫25℃避光反應(yīng)30分鐘。

l 洗滌：小心揭開(kāi)封板膜，用1×洗滌液每孔250 μL 洗滌微孔板，連續(xù)洗滌4~5次，每次浸泡30 S，用吸水紙拍干。

l 顯色：每孔加入底物溶液A50 μL，再加入底物溶液B50 μL輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后室溫25℃避光反應(yīng)15 min

l 測(cè)定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，加入終止液后5分鐘內(nèi)測(cè)定450 nm處吸光度值。

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