北京松信宏澤科技有限公司

：潘女士

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喹諾酮類ELISA試劑盒

1 概要

氟喹諾酮類抗生素(QNS)常用于防止大型畜產(chǎn)動物或養(yǎng)殖魚飼養(yǎng)時，由于飼養(yǎng)密度過高所造成的感染癥狀：尤其對于肺臟、泌尿及消化系統(tǒng)的細(xì)菌感染，氟喹諾酮類抗生素可達(dá)到預(yù)防與治療的效果。然而，氟喹諾酮類抗生素對人體常引發(fā)副作用包括:胃腸道及頭暈、失眠、頭痛等中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)。

近十年來，由于氟喹諾酮類抗生素用于大型畜產(chǎn)動物或養(yǎng)殖魚飼養(yǎng)明顯增加，及人民對于食品健康日益重視，上紛紛限制氟喹諾酮類抗生素用于大型畜產(chǎn)動物或養(yǎng)殖魚飼養(yǎng)。因此，監(jiān)測氟喹諾酮類抗生素殘留成為把守大眾健康刻不容緩的議題。

傳統(tǒng)上，一般是以HPLC篩選喹諾酮類抗生素殘留量，再以LC/MS/MS進(jìn)行zui后確認(rèn)；然而，此過程花費太多時間與經(jīng)費。因此，我公司開發(fā)出檢測時間少于90分鐘的氟喹諾酮類多合一ELISA試劑盒，本試劑盒操作簡便且省時、經(jīng)濟(jì)、檢測范圍廣(水產(chǎn)類與農(nóng)畜類樣品皆可適用)，且檢測靈敏度高。

本試劑盒可用于定量、定性檢測生乳、雞肉、魚肉、豬肉和蝦等樣品中氟喹諾酮藥物的殘留。

2 原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA法檢測樣品中的氟喹諾酮。在微孔板上預(yù)包被抗氟喹諾酮單克隆抗原，喹諾酮抗體和HRP標(biāo)記的喹諾酮二抗競爭結(jié)合微孔板中氟喹諾酮抗原以及標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品中的氟喹諾酮，洗滌后用H2O2-TMB底物系統(tǒng)顯色，樣品吸光度值與其所含喹諾酮量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出氟喹諾酮含量。

3 試劑盒組份

每個試劑盒中的試劑可進(jìn)行96個測量（包括標(biāo)準(zhǔn)測定），試劑盒組份：                                                                                                                  

包被有氟喹諾酮抗原的酶標(biāo)板---------------96孔（8孔/條×12條）

氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液---------------------------------6瓶（1.5 mL/瓶）

分別為0號：0 μg/L；1號：0.1 μg/L；2號：0.3 μg/L；3號：0.9 μg/L；4號：2.7 μg/L；5號：8.1 μg/L。

10×濃縮洗滌液-------------------------------------------1瓶（40 mL）

5×濃縮樣品復(fù)溶液---------------------------------------1瓶（40 mL）

抗體工作液 ---------------------------------------------1瓶（7 mL）

酶標(biāo)記物----------------------------------------------------1瓶（12 mL）

底物溶液A---------------------------------------------------1瓶（7 mL）

底物溶液B---------------------------------------------------1瓶（7 mL）

終止液--------------------------------------------------------1瓶( 7 mL）

封板膜-------------------------------------------------------------------1張

說明書-------------------------------------------------------------------1份4 另外所需試劑和儀器

4.1 試劑

l 正己烷（分析純）

l 乙腈（分析純）

l 乙酸yi酯（分析純）

l 二氯jia烷（分析純）

l 十二水合磷酸氫二鈉（分析純）

l 二水合磷酸二氫鈉（分析純）

4.2 儀器

l 恒溫培養(yǎng)箱

l 振蕩器

l 均質(zhì)機(jī)

l 天平(精確到0.01 g)

l 可調(diào)式 20~200 μL 和 100~1000 μL 微量移液器

l 酶標(biāo)儀（450 nm）

l 離心機(jī)

l 氮吹儀

4.3 溶液的配制

l 樣品復(fù)溶液：將5×濃縮樣品復(fù)溶液與去離子水（或蒸餾水）按照體積比1:4的比例，混合均勻

l 0.05 M PBS：稱取12.9 g十二水合磷酸氫二鈉和2.18 g二水合磷酸二氫鈉用去離子水（或蒸餾水）混合均勻定容至1 L

l 蜂蜜方法一提取液：量取35 mL乙酸yi酯和70 mL 二氯jia烷充分混合均勻

l 蜂蜜方法二提取液：稱取5 g氯化鈉，3 g十二水合磷酸氫二鈉，0.2 g氯化鉀，0.2 g磷酸二氫鉀用去離子水（或蒸餾水)充分溶解定容至500 mL

喹諾酮類ELISA試劑盒

5 樣品處理

5.1 牛肉、豬肉、雞肉、豬肝、雞肝

l 稱取1 g 均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入0.5 mL1×樣品復(fù)溶液，充分渦動20 S，再加入4.5 mL乙腈，用振蕩器振蕩渦旋5min直至組織*分散均勻

l 室溫4000 rpm離心10分鐘

l 取1 mL上清液于另一干凈10 mL離心管中于50~60℃氮氣吹干

l 加入1 mL正己烷充分振蕩渦旋30 S，再加入1 mL1×樣品復(fù)溶液，振蕩30 S，室溫4000 rpm離心5分鐘

l *棄除上層有機(jī)相以及中間層雜志，取下層液體待分析

l 雞肉、豬肉樣品，直接取50 μL下層液體用于分析，稀釋倍數(shù)為5倍

l 牛肉、豬肝、雞肝樣品，取100 μL下層液體和100 μL1×樣品復(fù)溶液，充分混合均勻后，取50 μL用于分析，稀釋倍數(shù)為10倍

5.2 魚肉、蝦肉（稀釋倍數(shù)為10倍）

l 取1 g均質(zhì)樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL 1×樣品復(fù)溶液，充分振蕩渦旋1 min使組織*分散，再加入8 mL乙腈充分振蕩混勻5 min

l 室溫4000 rpm離心10分鐘

l 取1 mL上清液于另一干凈10 mL離心管中于50~60℃氮氣吹干

l 加入1 mL正己烷充分振蕩渦旋30 S，再加入1 mL1×樣品復(fù)溶液，振蕩30 S，室溫4000 rpm離心5分鐘

l *棄除上層有機(jī)相以及中間層雜志，取下層液體50 μL用于分析

5.3 牛奶

純牛奶（稀釋倍數(shù)為10倍）

l 取50 μL純牛奶樣品于離心管中，加入450 μL1×樣品復(fù)溶液，震蕩混合約1分鐘

l 取50 μL用于分析

生鮮奶（稀釋倍數(shù)為1倍）

l 直接取新鮮生鮮奶50 μL用于分析（如果生鮮奶中脂肪含量過多，則室溫下4000 rpm離心10分鐘，去除上層脂肪）

5.4 蜂蜜

方法一：（稀釋倍數(shù)為2倍）

l 取1 g均質(zhì)樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL 0.05 MPBS（見配液）震蕩混合至蜂蜜*溶解，再加入8 mL蜂蜜方法一提取液（見配液）充分震蕩混合5 min

l 室溫4000 rpm離心10分鐘

l 棄去上層液體，取下層有機(jī)相4 mL于50~60℃氮氣吹干

l 加入1 mL正己烷充分振蕩渦旋30 S，再加入1 mL1×樣品復(fù)溶液，振蕩30 S，室溫4000 rpm離心5分鐘

l *棄除上層有機(jī)相以及中間層雜志，取下層液體50 μL用于分析

     方法二（稀釋倍數(shù)為4倍）

l 取1 g均質(zhì)樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL蜂蜜方法二提取液（見配液），渦旋震蕩至蜂蜜*溶解

l 加入4 mL乙腈充分振蕩混勻

l 室溫4000 rpm離心10分鐘

l 加入1 mL正己烷充分振蕩渦旋30 S，再加入1 mL1×樣品復(fù)溶液，振蕩30 S，室溫4000 rpm離心5分鐘

l *棄除上層有機(jī)相以及中間層雜志，取下層液體50 μL用于分析 

6 注意事項

l 使用前請先將喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶、樣品復(fù)溶/稀釋液、酶標(biāo)抗原、底物溶液及微孔條置于室溫下，至少回溫30分鐘。 

l 取出所需微量測試孔條，將剩余未測之孔條立即放回鋁箔袋中，置于2～8 ℃保存。

l 10×濃縮樣品復(fù)溶液與10×濃縮洗滌液請用蒸餾水稀釋10倍后使用，即10×濃縮樣品復(fù)溶液：蒸餾水= 1：9 稀釋，1×樣品復(fù)溶液和1×清洗液可于2～8℃保存一周。

7 操作步驟

l 試劑準(zhǔn)備：

1×洗滌液的配制，將10×濃縮洗滌液和蒸餾水（或去離子水）按1: 9充分混勻。

l 編號：將喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品對應(yīng)微孔按序編號，建議每個標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品均做重復(fù)孔。

l 加樣：每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液50 μL，然后每孔分別加入50 μL 氟喹諾酮抗體工作液。

l 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20～25℃）避光靜置30分鐘。

l 洗滌：小心揭開封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入1×洗滌液250 μL洗滌微孔板，連續(xù)洗板4~5次，每次間隔10S左右，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

l 加酶標(biāo)記物：每孔加入氟喹諾酮酶標(biāo)記物100 μL

l 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20～25℃）避光靜置30分鐘。

l 洗滌：小心揭開封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入1×洗滌液250 μL洗滌微孔板，連續(xù)洗板4~5次，每次間隔10S左右，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

l 顯色：每孔加入底物溶液A50 μL，再加入底物溶液B50 μL室溫（20～25℃）避光靜置15分鐘。

l 測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，測定450 nm處吸光度值。

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