常用設(shè)備

準(zhǔn)備室的設(shè)備：

單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲(chǔ)品柜（放置未消毒物品）、儲(chǔ)品規(guī)（放置消毒過(guò)的物品）、包裝臺(tái)。

配液室的設(shè)備：

扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計(jì)（測(cè)量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。

培養(yǎng)室的設(shè)備：

液氮罐、儲(chǔ)品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80℃）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。必須放在無(wú)菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO₂孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4℃冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。

無(wú)菌操作 

無(wú)菌室的滅菌：

1.定期打掃無(wú)菌室：每周打掃一次，先用自來(lái)水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3‰來(lái)蘇爾或者新潔爾滅或者0.5%過(guò)氧乙酸擦拭。

2.CO₂孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5%過(guò)氧乙酸，再用紫外燈照射。

3.實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開(kāi)紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20～30分鐘。

4.實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75%酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：

1.肥皂洗手。

2.穿好*、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋 。

3.用75%酒精棉球擦凈雙手。

無(wú)菌操作的演示：

1.凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、*的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面 。

2.靠近酒精燈火焰操作。

3.器皿使用前必須過(guò)火滅菌。

4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過(guò)火。

5.各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。

6.吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和消毒 

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1.自來(lái)水刷洗，除去灰塵。

2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%*中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小時(shí)后立即用自來(lái)水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來(lái)水沖干凈后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來(lái)水沖洗15次，zui后蒸餾水沖洗3～5次和用雙蒸水過(guò)3次。

5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。

6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開(kāi)開(kāi)關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時(shí)，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持20～30分鐘。

7.高壓消毒后烘干。

二、舊的玻璃器皿的洗消：

1．刷洗、烘干：使用過(guò)的玻璃器皿可直接泡入來(lái)蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過(guò)來(lái)蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來(lái)水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。

3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲(chǔ)存及防止灰塵和再次被污染。

4.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開(kāi)開(kāi)關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出3～5分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，調(diào)節(jié)電開(kāi)關(guān)維持20～30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）

5.烘干備用：因?yàn)楦邏合竞笃髅髸?huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。

金屬器械洗消：

金屬器皿不能泡酸，洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來(lái)水沖干凈，然后用75%酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。

橡膠和塑料：

橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來(lái)水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：

1 . 針式濾器帽不能泡酸液，用NaOH泡6～12小時(shí)，或者煮沸20分鐘，在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上（凹向上），然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。 

2. 膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過(guò)的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。zui后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。 

3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6～12小時(shí)（切記時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)），自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。zui后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。 

4. 膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：

6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70%酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開(kāi)蓋子，放在超凈臺(tái)臺(tái)面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2～3周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。用20000～100000rad的r射線消毒塑料制品效果。 

為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號(hào)，平時(shí)這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆（CoCI₂•6H₂O）2g，30%鹽酸10m1，蒸餾水88m1。 

注意事項(xiàng)：

1.嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時(shí)燒干，水不能過(guò)多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏?，?huì)降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。 

2.安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過(guò)濾的作用。

3.注意人體的防護(hù)和器皿的*浸泡：A.泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要*，不能留有氣泡，以防止泡酸不*。

細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒 

器材與試劑： 

干粉型培養(yǎng)基、*、*、*、純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。

具體步驟： 

一. 水的制備：

細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水 。

二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：

1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄•H₂O 1.56g，KH₂PO₄ 0.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。

三. *溶液的配制與消毒：

*的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)*的作用反應(yīng)不一樣。*分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，*溶液的作用能力zui強(qiáng)。使用*時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低*的活性，所以配制*溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca²⁺、Mg²⁺的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者*抑制劑終止*對(duì)細(xì)胞的作用。

1.稱取*：按*液濃度為0.25%，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過(guò)夜。 

2.用注射濾器抽濾消毒：配好的*溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。 

四.青、*溶液的配制于消毒 

1. 所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。

2.具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。*是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。*是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。

3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青*的濃度zui終為100單位/ml。1單位＝1微克？

五.RPMI1640的制備與消毒：

1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2～3次（沖洗液一并加入培養(yǎng)基中），充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?，并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品。然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青*液各0.5ml，使青*的濃度zui終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。zui后定容至1000ml，搖勻。

2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。

4.分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml*溶液（4℃時(shí)兩周有效）。

六.血清的滅活：

細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

七.HEPES溶液：

HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10～50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。 

1mol/LHEPE緩沖液配制方法如下：

準(zhǔn)確稱取HEPTS238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過(guò)濾除菌，分裝后4℃保存。

注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20mmol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過(guò)濾除菌后可*（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。

八.*：

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的*，其作用非常重要，細(xì)胞需要*合成核酸和蛋白質(zhì)，*缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的*。由于*在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50%，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有*的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的*。 

一般培養(yǎng)液中*的含量為1～4mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L*液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，*2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml*溶液。

九.肝素溶液的配制。

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中zui終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為*，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為4℃ 。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（可加入0.9ml）即可。 

十. Ⅰ型膠原酶：

0.1%Ⅰ型*同*一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比*大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。 

十一.明膠溶液：

因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1%明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）——即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是0.1%的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。 

其他培養(yǎng)用液的配制：

20ug/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。

注意事項(xiàng)：

1.配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值z(mì)ui終為7.2，可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。 

細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法） 

具體操作：

一. 傳代前準(zhǔn)備：

1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和*的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

2.用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。

3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。

5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。

6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。

8.打開(kāi)瓶口：將各瓶口一一打開(kāi)，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

二.*消化：

1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（*液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞，*消化溫度是37℃。

2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。

3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去*液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。

三.吹打分散細(xì)胞：

1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。

2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6～8分鐘。

4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

四.分裝稀釋細(xì)胞：

1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2～3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×10⁵/ml。zui后要做好標(biāo)記。

五.繼續(xù)培養(yǎng)：

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開(kāi)始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時(shí)為一個(gè)+，占50%為++，占75%時(shí)為+++。 

傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：

1.嚴(yán)格的無(wú)菌操。

2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附：EDTA（0.02%乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：

EDTA 0.20g，NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH₂PO₄ 0.02g，葡萄糖2.00g，0.5%酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要*清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁。上海友騰生物傾力為客戶提供上萬(wàn)種科研試劑，提供*、zui全、zui有效的科研試劑產(chǎn)品，質(zhì)量被全國(guó)各大院?？蒲袡C(jī)構(gòu)認(rèn)可。
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