一、基因組DNASouthern印跡的制備
　　
　　預(yù)備
　　
　　1．用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化基因組DNA樣品（10μg）。
　　
　　2．進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。一般用0.7～1.0％的瓊脂糖凝膠分離基因組DNA，它在1～15kb的范圍內(nèi)有較好的分辨率，可選用TBE或TAE緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳需在1V/cm的電壓下進(jìn)行，如果要分離片段大小相似的DNA帶，應(yīng)用較大的凝膠（20×25cm）。常用的標(biāo)準(zhǔn)品是由HindⅢ消化的λDNA、HaeⅢ消化的ΦX174DNA和100或1000bp的梯形圖譜。電泳完畢，將凝膠放在紫外透射儀上，并在凝膠旁放一尺子進(jìn)行拍照。當(dāng)把凝膠從盤(pán)內(nèi)移動(dòng)紫外透射儀時(shí)，小心不要將凝膠滑落或弄破。
　　
　　Southern印跡的制備
　　
　　1．將凝膠轉(zhuǎn)移至塑料盒內(nèi)。
　　
　　2．加入至少4倍凝膠體積的0.25mol/LHCl使DNA脫嘌呤，置室溫?fù)u床溫育15min。這時(shí)凝膠上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)應(yīng)變黃色，如果15min后仍呈藍(lán)色，應(yīng)再溫育5min。
　　
　　3．小心地塑料盒內(nèi)HCl棄去，用蒸餾水漂洗凝膠一次。
　　
　　4．加入至少4倍體積的變性緩沖液，置室溫?fù)u床溫育20min。
　　
　　5．用新鮮緩沖液重復(fù)步驟4，小心棄去變性緩沖液，用蒸餾水稍加漂洗。
　　
　　6．加入至少4倍體積的中和反應(yīng)緩沖液，置室溫?fù)u床溫育15min。
　　
　　7．用新鮮緩沖液重復(fù)步驟6。
　　
　　8．當(dāng)處理凝膠時(shí)，裁一張略大于凝膠的濾膜（硝酸纖維膜或尼龍膜），預(yù)先用蒸餾水將濾膜浸濕后用20×SSC浸泡至少15min。
　　
　　9．安裝轉(zhuǎn)移裝置。在盤(pán)中加入印跡緩沖液（20×SSC），在緩沖液面作一平臺(tái)，比如可倒置一凝膠盤(pán)，上面蓋三張經(jīng)20×SSC飽和過(guò)的濾紙（Whatman3MM），平臺(tái)兩側(cè)的濾紙應(yīng)浸泡在緩沖液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滾動(dòng)以趕出所有氣泡，并將濾紙推平。
　　
　　10．倒數(shù)毫升20×SSC于濾紙表面，將凝膠面向下倒扣在濾紙上，小心趕出凝膠與濾紙間的氣泡，凝膠四周用膠布或塑料薄膜包裹以防緩沖液從凝膠周?chē)苯恿髦良堉校ê缥搪罚?br />　　
　　11．加數(shù)ml20×SSC浸沒(méi)凝膠，表面覆以濾膜，確保凝膠與濾膜之間無(wú)氣泡。
　　
　　12．裁三張大小合適的3MM濾紙，用20×SSC浸濕后鋪在濾膜表面。
　　
　　13．放一疊干燥的吸水紙（印跡紙或紙巾）在3MM濾紙上（約5～8cm高）。
　　
　　14．置一玻璃板于吸水紙上，其上放一重約0.75～1kg的物體。
　　
　　15．DNA轉(zhuǎn)移可進(jìn)行12～16h（如過(guò)夜），確保槽內(nèi)有足夠的20×SSC（1～3L）。
　　
　　16．毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移完畢，小心拆卸印跡裝置。將膜與凝膠一起轉(zhuǎn)移至干燥的濾紙上，凝膠在上，用軟鉛筆標(biāo)記凝膠和濾膜的加樣孔位置，撕去凝膠。
　　
　　17．用5×SSC漂洗雜交膜以去除瓊脂糖殘跡。
　　
　　18．將濾膜放在一張干燥的3MM濾紙上稍微晾干。
　　
　　19．固定DNA于濾膜上，若用硝酸纖維素膜，在80℃真空箱中烤2h；若用尼龍膜，將DNA面朝下暴露于紫外透射儀3～5min。
　　
　　20．這時(shí)的濾膜已可用于雜交，或貯存在4℃。硝酸纖維素膜需真空保存，尼龍膜需用塑料薄膜密封。
　　
　　二、DNA印跡雜交
　　
　　1．用5×SSPE浸滲DNA濾膜。
　　
　　2．將浸濕的DNA濾膜放入塑料袋內(nèi)，袋的四邊密封并剪去一角。
　　
　　3．從缺口處加入預(yù)雜交液（0.1ml/cm2），避免加入氣泡，將袋中的氣泡全部擠出，封口。
　　
　　4．將塑料袋置水浴搖床中溫育，或夾在兩塊玻璃板中置65℃烤箱2～4小時(shí)，確保濾膜表面無(wú)氣泡。
　　
　　5．在95℃10min使探針變性，立即置冰浴冷卻5min。
　　
　　6．剪去雜交袋的一角，將預(yù)雜交液倒入15或50ml的Falcon試管中，將約10～20ng/ml（隨機(jī)引物標(biāo)記的）或50～100ng/ml（缺口平移法的）探針加到預(yù)雜交液或新鮮配制的雜交緩沖液中（如果打算用硫酸葡聚糖）。一般來(lái)說(shuō)，106～107cpm/ml已足夠，輕輕混勻，用一次性的塑料移液管將雜交液加到塑料袋內(nèi)的濾膜上。
　　
　　7．從開(kāi)角處將雜交液袋內(nèi)的氣泡全部擠出，用紙巾吸去流出的少許雜交液，小心封口以防雜交液漏出。必要的話，可將此雜交袋套在另一塑料袋中以防放射性污染。
　　
　　8．在65℃水浴搖床中溫育或夾在兩塊玻璃板中置烤箱烘烤12～16h。
　　
　　9．雜交后，剪去雜交袋的一角，擠出雜交混合液倒入15或50ml的Falcon管中，小心不要使放射性溶液濺出。
　　
　　10．將雜交袋*打開(kāi)，用鈍頭鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至盤(pán)內(nèi)以便漂洗，立即用緩沖液1（2×SSC，0.1％SDS）洗濾膜。
　　
　　11．室溫下，用漂洗緩沖液1漂洗濾膜三次，每次5min。
　　
　　12．室溫下，用漂洗緩沖液2（0.25×SSC，0.1％SDS）漂洗濾膜兩次，每次5min。
　　
　　13．在65℃用預(yù)熱的漂洗緩沖液2洗膜1～3次，每次15min。在更換緩沖液之間，應(yīng)用蓋革計(jì)數(shù)器檢測(cè)滯留在印跡中心的放射性（將印跡中心所期望的特異性信號(hào)與印跡邊緣所期望的本底信號(hào)相比較）。
　　
　　14．充分漂洗后，將濾膜放在一張3MM的濾紙上稍微晾干，將潮濕的濾膜封在薄塑料袋內(nèi)或用塑料薄膜包裹。
　　
　　15．濾膜的放射自顯影：將印跡膜（封在塑料袋內(nèi)，DNA面朝上）放在X射線暗盒底部，其上放置（攝影的）膠片，增感屏常規(guī)貼在盒蓋內(nèi)面，關(guān)閉暗盒，在－70℃進(jìn)行放射自顯影過(guò)夜兩周。上海友騰生物傾力為客戶提供上萬(wàn)種科研試劑，提供*、zui全、zui有效的科研試劑產(chǎn)品，質(zhì)量被全國(guó)各大院?？蒲袡C(jī)構(gòu)認(rèn)可。
　　
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