一、實(shí)驗(yàn)原理

植物患病組織內(nèi)的真菌菌絲體，如果給予適宜的環(huán)境條件，除個(gè)別種類(lèi)外，一般都能恢復(fù)生長(zhǎng)和繁殖。植物病原菌的分離就是指通過(guò)人工培養(yǎng)，從染病植物組織中將病原真菌與其它雜菌相分開(kāi)，并從寄主植物中分離出來(lái)，再將分離到的病原菌于適宜環(huán)境內(nèi)純化，這個(gè)過(guò)程總稱(chēng)植物病菌的分離培養(yǎng)。植物病原真菌的分離一般都是采用組織分離法，就是切取小塊病組織，經(jīng)表面消毒和滅菌水洗過(guò)后，移到人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

植物病原菌的分離培養(yǎng)是植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)zui基本的操作技術(shù)之一，它對(duì)原害鑒定，病原形態(tài)觀(guān)察、植物病害接種體的培養(yǎng)等方面都是經(jīng)常使用的研究手段。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，要求植物病原菌分離培養(yǎng)的一般原則和方法。

三、實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備

1．分離材料：梨黑斑病(Alternaria kikuchiana)，柿樹(shù)圓斑病(Pestnlotia sp)及杉木炭疽病(Glomerella cingolata)新發(fā)病的病葉；楊樹(shù)爛皮病(Cytospora chrysosperma)國(guó)槐腐爛病(Dothiorella sp.)的帶有新病斑的枝條；油松種子。

2．分離用具(每小組為單位)

酒精燈4個(gè)，*4把，*4把，PDA培養(yǎng)基3瓶，培養(yǎng)皿(Φ9cm)24套，小燒杯(5ml)4個(gè)，大燒杯1個(gè)，斜面培養(yǎng)基12管，滅菌水4瓶，75%酒精瓶1個(gè)(內(nèi)放脫脂棉球)0.1%升汞瓶1個(gè)，5%乳酸瓶(60ml)1個(gè)，火柴1盒，濕、干紗布各4張。

四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟

(一)分離前的準(zhǔn)備工作

1．工作環(huán)境的清潔和消毒

分離培養(yǎng)一般在無(wú)菌室、無(wú)菌箱或無(wú)菌工作臺(tái)(超凈工作臺(tái))上進(jìn)行，無(wú)菌室和無(wú)菌箱要經(jīng)過(guò)噴霧除塵，并用藥物或紫外線(xiàn)照射消毒(常用消du藥物為70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等噴霧。若用紫外線(xiàn)燈照射則需20-30分鐘)。在沒(méi)有上述設(shè)備條件時(shí)，在清潔房間里關(guān)閉門(mén)窗，避免空氣流動(dòng)，經(jīng)過(guò)噴霧除去空氣及地面灰塵后進(jìn)行操作，也可獲得較好的結(jié)果。工作前擦凈桌面，鋪上濕紗布。將所需用的物品按次序放在工作臺(tái)上，避免工作時(shí)走動(dòng)，工作人員穿上滅菌后的工作服，帶上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新潔爾滅擦手。

2．分離用具的消毒

凡是和分離材料接觸的器皿(刀、剪、鑷、針等)都要隨時(shí)(至少在使用時(shí))保持無(wú)菌，將這些用具浸于70%酒精中，使用時(shí)在燈焰上滅菌燒去酒精，如此2-3次(刀、剪、鑷等不宜在燈焰上燒時(shí)過(guò)長(zhǎng)，以防退火)。再次使用時(shí)必須重復(fù)滅菌。培養(yǎng)皿、試驗(yàn)等要經(jīng)過(guò)干熱滅菌。培養(yǎng)基及洗滌或稀釋用蒸餾水都需要事先經(jīng)過(guò)高壓蒸氣滅菌。

3．分離材料的選擇

用新發(fā)病的植株、器官或組織做為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植物壞死部分的內(nèi)部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑點(diǎn)病害應(yīng)從鄰近健全組織，即從病、健組織交界處獲得分離材料。