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ELISA實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性、陽性和空白對照的作用

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一.ELISA試驗(yàn)有效性與三項(xiàng)對照 
什么是“有效性”(Validity)?要獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果“有效性”評價,就會關(guān)系到:為什么要設(shè)置“陰性、陽性和空白”等*的三項(xiàng)對照?要用什么樣的物質(zhì)擔(dān)當(dāng)“陰性、陽性和空白對照(品)”?這“三項(xiàng)對照”如何設(shè)置、需要設(shè)置幾個孔位?獲得的測定值如何“認(rèn)可、取舍與計(jì)算”?隨后,又如何依照陽性對照均值(PCx)與陰性對照均值(NCx)的差值(P-N,或N-P)大小做出“試驗(yàn)結(jié)果有效性”的zui終裁決呢?…等等,這一連串的問題,在國外“正規(guī)”品牌的ELISA試劑《使用說明書》中都有明細(xì)和詳盡的說明。既有理論要點(diǎn)提示,又有具體細(xì)致的舉例解說。很可惜,在90年前后,國內(nèi)興起ELISA檢測熱潮之際,在一片“國外試劑說明書太詳細(xì)、太復(fù)雜、不容易看明白、…”等等“一片埋冤”聲中,正好迎合國內(nèi)商家的“意愿”。從此以后,國產(chǎn)ELISA試劑的說明書,越來越簡單。這其中商家就有兩個“好處”:好處之一,用A4、或B5,甚至比B5還要小的一張紙,代替試劑的好幾頁的“使用說明書”(等同于一份“操作手冊”),每年就可節(jié)省一大筆印刷成本費(fèi);好處之二,如同試劑說明書上向用戶交待的各種表明本試劑質(zhì)量有關(guān)的詳盡內(nèi)容,國產(chǎn)試劑的所謂“說明書”上統(tǒng)統(tǒng)可以“刪除、回避、拒絕”向用戶通報和承諾。我90年前后收集的<美>雅培、<法>巴斯德、<荷>阿克蘇等相關(guān)試劑的原文說明書,幾經(jīng)搬動全都處理,很是可惜。近日,杭州*朋友送了一份生物梅里埃中國有限公司的中文版《*(酶聯(lián)免疫法)使用說明書》。對照閱讀之下,深深感到這才是一份真正意義上的《使用說明書》呀!在我下文提到的若干“概念、問題”,從中都可以找到答案。我現(xiàn)在參照我本人1993年的《肝炎ELISA試劑質(zhì)量與檢測結(jié)果有效性評價》會議講稿相關(guān)內(nèi)容,就“三項(xiàng)對照與檢測結(jié)果有效性”表示如下認(rèn)識和討論。 
二.三項(xiàng)對照要求與用途 
ELISA檢測,按照試劑說明書要求,每次試驗(yàn)、每塊扳上都要設(shè)置以下3項(xiàng)對照和用途:   
1.空白對照:僅用稀釋液代替檢測樣本、用以觀測zui終反應(yīng)的顯色“本底”、并用于酶標(biāo)儀消除、扣除“本底”,即:以本底為“零”讀取陽性、陰性對照孔和樣本檢測孔的吸光值(A);或者,在計(jì)算陰性對照均值(NCx)、陽性對照均值(PCx)、樣本讀數(shù)的S/C.O.值時減去空白對照的本底吸光值。早年的酶標(biāo)儀無自動扣除空白對照孔讀數(shù)功能,這種酶標(biāo)議現(xiàn)已淘汰不用了,寫上這段話的意思是補(bǔ)充說明設(shè)置空白對照的用途??瞻卓拙唧w如何讀取讀數(shù),則依照說明書操作。例如,生物梅里埃中國有限公司的中文版《*(酶聯(lián)免疫法)使用說明書》上提示:以空氣讀空白(不放板架和板條),在450nm(單波長)、或450nm和620—700mn(底物是TMB)參考波長進(jìn)行讀數(shù)。  
2.陰性對照(品):  
(1)陰性對照(品)的概念與要求:所謂陰性對照(品),應(yīng)當(dāng)是本項(xiàng)檢測試驗(yàn)中采用與待撿物(樣品、人用試劑就是人的血清等)具有同源性和同質(zhì)性,又不含有待檢物質(zhì),并能客觀比較和鑒別處理因素(血清免疫學(xué)試驗(yàn)中有特異性抗原與抗體反應(yīng))之間的差異。因此,用動物血清或其制品(如牛血清白蛋白等)代替陰性人血清作為對照品,從理論和實(shí)踐上都是不可取的,弊端甚多,無須細(xì)述。注意:據(jù)我所知,國產(chǎn)ELISA試劑中,有的廠牌是用動物血清制品稀釋配置、或與部分人血清混合配置的;其二,陰性對照讀數(shù),并非是“越低越好”。NCx值接近0.00X水平,這是假象!試想一下,真正采用“陰性人血清”的陰性對照品,NCx值會如此之低嗎?舉個例子,雅培乙肝六項(xiàng)EIA試劑的NCx值,分別為:0.010(HBsAg)、0.027(抗—HBs)、0.035(HBeAg)、1.083(抗—HBe)、1.065(抗—HBc)、0.045(抗HBc-IgM)。生物梅里埃的HIV試劑NCx是0.091。辨別試劑NCx值是否合理的一個很簡單的方法,只要對比大量陰性樣本的實(shí)際讀數(shù)就“一目了然”啦!  
一個題外插曲:表明ELISA試劑內(nèi)在質(zhì)量的一個重要統(tǒng)計(jì)標(biāo)志,就是要看:陰性樣本的的上限不應(yīng)當(dāng)大于、必須小于C.O.I.=1.00;反之,陽性樣本的的下限不可小于、應(yīng)當(dāng)大于C.O.I.=1.00!早年我用SPSS軟件輸出阿克蘇HIV和國產(chǎn)甲、乙試劑檢測600例左右的健康人體檢血清的三幅直方圖,可以表明陰性樣本的不同分布特征,頗有意思。    
我為什么要如此細(xì)說NCx呢?因?yàn)镹Cx值在Cut off值計(jì)算中是相當(dāng)舉足輕重的(詳后)。 
(2)陰性對照(品)分為兩類  
一是代表受檢人血清中并不含有、或方法學(xué)靈敏度未能檢出的待檢物的基準(zhǔn)水平,并且是結(jié)果判斷值(Cut off)計(jì)算式中決定“是”(陽性)、或“否”(陰性)的*可變值。陰性對照值高,導(dǎo)致假陰性;反之,導(dǎo)致假陽性。如:HBsAg、HBeAg、抗—HBc等。二是陰性對照設(shè)置,在方法學(xué)上要求加入指示性定量標(biāo)準(zhǔn)品,如中和劑HBeAg,定量HBcAg等,用以檢測抗—HBe、抗—HBc?;蛘撸x取代表平均水平的正常人血清用作陰性對照,如檢測抗—HBc IgM。此類Cut off 值計(jì)算時,多數(shù)均包括陰性和陽性對照值2個可變值。                 
3.陽性對照(品):  
(1)陽性對照(品)的概念與要求:同陰性對照(品),只是采用“精選”的含有待檢物質(zhì)的人血清制備而成。所謂“精選”,就是把收集的陽性人血清經(jīng)過數(shù)種試驗(yàn)進(jìn)行“篩試”、把含有“干擾性物質(zhì)”的血清剔除、不用,以避免出現(xiàn)“假陽性”干擾試驗(yàn)結(jié)果。   
(2)陽性對照(品)設(shè)置,也可區(qū)分為兩種類型與用途:  
一是陽性對照主要用于評價該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果是否有效和試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性與可比性。而所設(shè)的陽性對照的測量值不列入Cut off值計(jì)算、但是不可不做。如HBsAg、抗—HBs、HBeAg等。  
二是陽性對照的設(shè)置,不僅用于評價試驗(yàn)結(jié)果是否有效和試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性與可比性,而且計(jì)入Cut off的計(jì)算。此時的Cut off值的含義是代表該標(biāo)志物在健康(正常)人群中正常值范圍的上限。待檢樣本檢測值超過該上限(Cut off)時表示有診斷意義。例如抗—HBe、抗—HBc、抗—HBc IgM等。

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