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人AAVS1位點(diǎn)的TALENs質(zhì)?;钚则?yàn)證

時間:2014-4-15閱讀:3924
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人AAVS1位點(diǎn)的TALENs質(zhì)粒活性驗(yàn)證

摘要:利用T7E1 活性分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AAVS1位點(diǎn)的TALENs質(zhì)粒對的活性。實(shí)驗(yàn)表明,該質(zhì)粒對可以識別CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列,切割效率約為10%。配合Donor質(zhì)粒,可以地將外源基因定點(diǎn)插入到AAVS1位點(diǎn)。可用于篩選定點(diǎn)整合穩(wěn)定細(xì)胞株。
關(guān)鍵詞:T7E1,AAVS1,TALENs, 定點(diǎn)整合穩(wěn)定細(xì)胞株

 

一、 實(shí)驗(yàn)原理
在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)針對AAVS1位點(diǎn)的TALENs質(zhì)粒, TALENs質(zhì)粒會表達(dá)相應(yīng)的蛋白如果具有切割活性將會在識別位點(diǎn)中間預(yù)測的位置造成DNA雙鏈斷裂,在細(xì)胞進(jìn)行易錯修復(fù)后造成隨機(jī)的突變(一般會缺失部分堿基,某些情況下也會添加)。當(dāng)利用引物切割位點(diǎn)上下游的引物進(jìn)行PCR的時候,產(chǎn)物為兩類PCR產(chǎn)物的混合物:正常序列的PCR產(chǎn)物和突變序列的PCR產(chǎn)物。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性和退火以后,這兩類產(chǎn)物會隨機(jī)配對,會有一部分正常序列的PCR產(chǎn)物和突變序列的PCR產(chǎn)物組成雜合鏈。在使用可以特異識別不*配對區(qū)域的T7E1酶處理后,雜合鏈將會被切斷。利用DNA PAGE膠,相對于對照組會有預(yù)測大小的切割條帶出現(xiàn)。如果TALENs質(zhì)粒沒有活性,則不會有切割條帶出現(xiàn)。

 

二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
驗(yàn)證識別CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列的TALENs切割質(zhì)粒對在293T細(xì)胞中的切割活性。

 

三、 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 引物設(shè)計(jì)合成:
AAVS1-F1-311 : CCTGTCATGGCATCTTCC
AAVS1-R1-311 : TAAGGAATCTGCCTAAC
位于TALENs識別位點(diǎn)上下游,可獲得311bp長PCR產(chǎn)物,用于T7E1實(shí)驗(yàn)。
2. TALENs細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:
293T細(xì)胞70%匯合度時按照轉(zhuǎn)染試劑說明書,共轉(zhuǎn)AAVS1 TALENs質(zhì)粒, 同時轉(zhuǎn)染TALENs空質(zhì)粒作為對照, 轉(zhuǎn)染3天后, 收集樣品, 抽提基因組DNA。
3. PCR:將基因組DNA作為模板,使用AAVS1-R1-311和AAVS1-F1-311引物進(jìn)行PCR,得到311bp產(chǎn)物。

                                                                   PCR反應(yīng)體系

                                        

 

                                                           PCR循環(huán)條件
                                           

                                                           1    2    3

                                                      

1. Con
2. TALENs treated
3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp

4. T7E1活性分析實(shí)驗(yàn)-退火:
取以上PCR產(chǎn)物(311bp)各10μl, 放入PCR按照以下程序進(jìn)行退火: 95℃ 5 min, 以-2度/秒的速度降至85度,再以-0.1度/秒降至25度, 4℃保存。
5. T7E1活性分析實(shí)驗(yàn)-酶切:
每個樣品加入1μl T7E1酶,37℃酶切40min。
6. T7E1活性分析實(shí)驗(yàn)-DNA PAGE電泳,染色:
酶切好的樣品加入5X Orange G 上樣緩沖液,在12%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,使用1XTBE作為電泳緩沖液,恒壓80V電泳15min后150V電泳至 Orange G染料至底部。凝膠取下后,在50ml 1XTBE 中加入10μl gold view 染料,搖床震蕩10min后,用去離子水洗三次。紫外凝膠成像儀觀察,拍照。

                                

                                   
                                             圖1. T7E1切割活性檢測PAGE膠電泳圖

 

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
T7E1活性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
TALENs轉(zhuǎn)染組的T7E1酶切后可見兩條預(yù)測大小的切割條帶(~208bp,~103bp),在對照組同樣位置沒有發(fā)現(xiàn)同樣大小的條帶。結(jié)果證實(shí)pTALEN-AAVS1-F和pTALEN-AAVS1-R質(zhì)粒對在293T細(xì)胞中具有切割活性。經(jīng)過灰度分析,切割效率約為10%。

 

五、 參考文獻(xiàn)
1. Ramakrishna S, Kim YH, Kim H.Stability of zinc finger nuclease protein is enhanced by the proteasome inhibitor MG132. PLoS One. 2013;1:e54282

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