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上海誠凜生物科技有限公司

Western Blot內(nèi)參抗體選擇原則

時間:2014-4-21閱讀:561
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內(nèi)參抗體種類很多,比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等,那么針對自己的實驗,我們該如何選擇呢?下面簡單介紹下選擇內(nèi)參抗體應(yīng)遵循的原則:

一.樣本種屬來源:

首先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。

1、哺乳動物的組織或者細胞樣本,通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。

2、植物來源實驗樣本,則可以選擇plant actin、Rubisco等。

3、其他來源樣本研究較少,所以就應(yīng)該參照文獻報導(dǎo),選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。

二.目的蛋白分子量:

選擇內(nèi)參抗體時,應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD,此時不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參,可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。

三.目的蛋白表達部位:

就一般的蛋白檢測來說,β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了,而針對于核蛋白的定量,特別是樣本蛋白就是核蛋白時,選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價值。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等,在一些文獻報道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測,常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測,常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。

以上幾條原則只是針對通常情況,但是需要注意的問題是——內(nèi)參的選擇需要考慮實際的試驗環(huán)境,比如某些細胞中,由于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達增高,不適合做內(nèi)參。比如在涉及細胞增殖相關(guān)試驗中,c-Jun由于自身表達變化就不適合做內(nèi)參;而在凋亡實驗時,TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)參。因此設(shè)計實驗方案的時候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻,在實驗過程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達出現(xiàn)異常,應(yīng)考慮這方面因素。

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