人8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA檢測(cè)試劑盒
用 途： 用于人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的測(cè)定。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用的是*雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定樣品中人8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的水平。向預(yù)先包被了人8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，溫育；溫育后，加入*標(biāo)記的抗8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG) 抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中人8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的濃度呈正相關(guān)。
人8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA檢測(cè)試劑盒組成
| 名 稱 | 96孔配置 12孔×8條 | 48孔配置 12孔×4條 | 備 注 |
1 | 標(biāo)準(zhǔn)品（80ng/ml) | 0.5ml | 0.5ml | 稀釋即用型 |
2 | 酶標(biāo)包被板 | 1塊 | 1塊 | 已包被即用型 |
3 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 3ml | 3ml | 即用型 |
4 | 鏈霉親和素-HRP | 6ml | 3ml | 即用型 |
5 | 30x倍濃縮洗滌液 | 20ml | 20ml | 蒸餾水稀釋 |
6 | *標(biāo)記的抗-8-OHdG 抗體 | 2ml | 2ml | 即用型 |
7 | 顯色劑A液 | 6ml | 3ml | 即用型 |
8 | 顯色劑B液 | 6ml | 3ml | 即用型 |
9 | 終止液 | 6ml | 3ml | 即用型 |
10 | 說明書 | 1份 | 1份 | 即用型 |
11 | 封板膜 | 2張 | 2張 | 不可反復(fù)使用 |
12 | 密封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 即用型 |
需要而未提供的試劑和器材
- 酶標(biāo)儀(450nm檢測(cè)波長(zhǎng)濾光片，570nm或630nm校正波長(zhǎng)濾光片) 。
- 洗板機(jī)（可調(diào)注液量，保證每孔洗液加至0.35ml而不溢出）。
- 超凈工作臺(tái)，生物安全柜，通風(fēng)柜。
- 高精度單道加液器（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
- 高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl).
- 37℃恒溫箱。
- 低溫離心機(jī)。
- 電冰箱（4℃,-20℃,-86℃）.
9. 漩渦混合儀，低頻振蕩器等
人8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)
- 從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
- 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
- 為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
- 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
- 底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。
6. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時(shí)必須注意安全。
7. 各步驟加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校準(zhǔn)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
8. 每次試驗(yàn)測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔zui高濃度的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）。
9. 配制試劑時(shí)，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻?qū)y(cè)試結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板1分鐘，例如做圓周動(dòng)作，使加入孔中的反應(yīng)液混勻。
10. 實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)儀應(yīng)嚴(yán)格按使用說明書規(guī)范操作，并在使用前充分預(yù)熱。
11. 手工洗板應(yīng)注意：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
樣本要求
1．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存或根據(jù)存放，時(shí)間做相應(yīng)溫度調(diào)整，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，（由于樣本種類過多，每個(gè)單位處理方式不一樣，本說明書不做詳細(xì)介紹）。
操作程序
- 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：（本試劑系統(tǒng)提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶請(qǐng)按照說明自行在小試管中倍比稀釋）按下表格執(zhí)行：
40ng/ml | （5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
20ng/ml | （4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
10ng/ml | （3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
5ng/ml | （2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
2.5ng/ml | （1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 120μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
- 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
- 加樣：1）空白孔：（空白對(duì)照孔不加樣品，*標(biāo)記的抗8-OHdG抗體，鏈霉親和素-HRP，其余各步操作相同 ；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔:加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl，鏈霉親和素-HRP50μl（標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好*標(biāo)記抗體，故在操作時(shí)不加，只加*-HRP）；3）樣本反應(yīng)孔：加入樣本40μl，然后各加入抗- HA抗體10μl、鏈霉親和素-HRP（空白孔除外）50μl。蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60分鐘。
- 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋備用。
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
- 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
- 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
- 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
結(jié)果判斷
1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。（若不減零孔值，標(biāo)準(zhǔn)曲線的零孔應(yīng)相交于Y軸）
2. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種熟悉應(yīng)用軟件來計(jì)算。
3．手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析計(jì)算結(jié)果。
4．若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
操作總結(jié)
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，*標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)60分鐘。
洗板5次，加入顯色液A、B,37℃顯色10分鐘
加入TMB終止液
10分鐘內(nèi)酶標(biāo)儀測(cè)OD值
計(jì)算待測(cè)樣本因子含量
試劑盒性能
- 準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9200。
- 靈敏度：zui小可檢測(cè)濃度達(dá)，0.3125ng/ml。
- 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
- 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5 . 回收率：70-110%.
6. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
7. 有效期：6個(gè)月
8. 檢測(cè)范圍：60ng/ml -1.25ng/ml
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