小鼠白介素6(IL6)ELISA試劑盒測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因分析

ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是一種常用的固相酶免疫測(cè)定方法。Engvall 和Perlmann于1971年zui先應(yīng)用該法進(jìn)行了IgG定量測(cè)定，并命名為"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。 ELISA的基本原理是：

①使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；

②使抗原（或抗體）與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原（或抗體），而且此酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；

③測(cè)定時(shí)將受檢標(biāo)本（抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原（或抗體）按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成一定比例；再加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)其顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析，以了解被測(cè)標(biāo)本中抗體或抗原含量。

小鼠白介素6(IL6)ELISA試劑盒添加回收的幾種誤區(qū)：

    呋喃類代謝物提取過(guò)程通常分三個(gè)關(guān)鍵步驟：

 水解-----衍生化-----提取

 (1)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的zui大標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行添加回收。如德國(guó)拜發(fā)和我公司AOZ試劑盒中的第6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)4.05ppb，AMOZ試劑盒中的第6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)8.1ppb。因?yàn)檫@些標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)過(guò)衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品，不能代表樣本前處理實(shí)驗(yàn)中的加酸水解和加衍生化試劑衍生這兩個(gè)步驟，所以就算回收率很高，但失去了實(shí)際參考價(jià)值。

 （2）*依賴未衍生的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收。因部分未衍生的代謝物在配制成標(biāo)準(zhǔn)品后有一定的有效期，會(huì)存在潛在的不穩(wěn)定因素，而且添加回收僅能考證衍生化和提取兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，不能驗(yàn)證從組織蛋白中水解呋喃類代謝物的過(guò)程，因此也有一定的局限性。

 的評(píng)價(jià)方案：采用經(jīng)LC-MS-MS確證的陰陽(yáng)性樣品，留作質(zhì)控樣品，對(duì)檢測(cè)的樣本和試劑盒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。這也是實(shí)驗(yàn)室所出數(shù)據(jù)可信度說(shuō)服力的關(guān)鍵點(diǎn)。

加樣

 在小鼠白介素6(IL6)ELISA試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

  加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。

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