ELISA試劑盒工作濃度的選擇

在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因?yàn)槊笜?biāo)記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的波動(dòng)。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗(yàn)前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。

酶標(biāo)記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標(biāo)記抗體的效價(jià)，或稱工作濃度。

其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時(shí)后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應(yīng)。

結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫座標(biāo)，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該標(biāo)記物的工作濃度。

有關(guān)試驗(yàn)的試劑及器材均見ELISA部分。

C要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實(shí)際應(yīng)用中的zui適濃度可相差幾個(gè)滴度。這就要求在建立ELISA實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進(jìn)一步確定實(shí)際工作濃度(可采用方陣法)，以達(dá)到zui適的實(shí)驗(yàn)條件。