數(shù)字PCR方案介紹

傳統(tǒng)的熒光定量PCR，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，已是很成熟的實(shí)驗(yàn)方案了。其中，zui常用的是Taqman法和SYBR Green法。而在這二種方法當(dāng)中，Taqman法又以其特異性高、定量，得到廣大用戶的認(rèn)可。

但是Taqman法PCR，它還是一個(gè)相對(duì)定量的辦法。它測(cè)的是一個(gè)Ct值，也就是PCR到第幾個(gè)循環(huán)，熒光強(qiáng)度達(dá)到了一個(gè)設(shè)定值。

要想用Taqman方法得到：樣本中到底有幾個(gè)目標(biāo)基因的拷貝，那么還是要再做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的（qPCR）曲線。才能知道樣本的Ct值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的哪個(gè)位置上。再進(jìn)一步推算出樣本中的拷貝數(shù)量。

這樣做，它首先要做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，那么，當(dāng)然它就增加了工作量。另一方面，因?yàn)橐肓藰?biāo)準(zhǔn)品，而標(biāo)準(zhǔn)品也多少是有一定誤差的。所以，實(shí)驗(yàn)中又多引入了一個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差變量。

科學(xué)家為了克服傳統(tǒng)定量PCR的上述兩個(gè)弱點(diǎn)，那么又新發(fā)明了微滴數(shù)字PCR。

微滴數(shù)字PCR的原理，就是把原來(lái)一整管的PCR反應(yīng)液，分散成幾萬(wàn)個(gè)，甚至幾百萬(wàn)個(gè)極微小的液滴。這些小微滴同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，這樣就可以計(jì)算出原來(lái)的反應(yīng)液當(dāng)中，有多少個(gè)目標(biāo)基因的拷貝了。

了解了原理之后，我們來(lái)看看商業(yè)公司的實(shí)現(xiàn)方案。其中Bio-Rad公司和RainDance公司采用了油包水PCR的方法，用油把PCR反應(yīng)液分隔成等體積的小液滴，再進(jìn)行PCR反應(yīng)。Life公司采用了芯片的方法，在芯片上預(yù)制了2萬(wàn)個(gè)小孔，把PCR反應(yīng)液，物理地注入到芯片上的小孔中，密封后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

在本期的課程當(dāng)中，我們將以Bio-Rad公司的儀器和方法為例，來(lái)介紹ddPCR。