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北京平利洋經(jīng)貿(mào)有限公司

組織均質(zhì)勻漿中蛋白提取

時(shí)間:2014-8-12閱讀:1157
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整個(gè)組織(或者一部分組織,比如1克,具體需要考慮組織的大小和所含藥物量及方法的檢測(cè)限),置于適當(dāng)?shù)娜萜髦校ū热缭嚬埽?ml 15ml),加入適當(dāng)體積的適當(dāng)溶劑(體積可采用1:2,即1g組織用2ml溶劑,至于溶劑的種類,可選擇水、甲醇、乙腈等,具體需要考慮藥物的溶解性),然后以 18000rpm的OmniTH Prep多樣品剪切勻漿機(jī) 或 6m/s  Omni Bead Ruptor 24多樣品研磨珠進(jìn)行勻漿 (時(shí)間大約1min),直至獲得均一的勻漿液,然后超聲5min(為充分溶出藥物,但須考慮藥物的穩(wěn)定性)、3500g離心5min,分取上清液。然后按照與血漿的預(yù)處理方法繼續(xù)處理進(jìn)樣測(cè)定即可。


上述操作的主要目的是將組織細(xì)胞中的藥物*溶解出來,從而能夠測(cè)定全部的藥物濃度。因此如果采用細(xì)胞破碎儀OMNI Sonic Ruptor 250和Sonic Ruptor 400也可以。

 

但在操作中需要考慮藥物的穩(wěn)定性。畢竟高速勻漿會(huì)產(chǎn)熱導(dǎo)致藥物降解。


勻漿時(shí)保持低溫,因?yàn)?0度左右代謝酶會(huì)產(chǎn)生活性,可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。

 

勻漿的目的是什么?應(yīng)該是測(cè)里面的某種成分的含量或活性吧,或者其他目的。冰水浴的目的是什么?防止活性成分分解或滅活。如果你要測(cè)的東西穩(wěn)定性做夠好,沒必要冰水浴

組織勻漿的時(shí)候需要在冰上操作,加蛋白酶抑制劑

盡量在冰上,溫度當(dāng)然是低些,以防蛋白降解還怕尿素分解,以致于氨甲基化修飾蛋白,影響后面的質(zhì)譜鑒定

控制在低溫  不要連續(xù)勻漿可以每勻漿10秒 就把勻漿的容器放置于冰水混合物中降溫,然后再勻漿,這樣可以減少對(duì)目的物的損傷

操作步驟:參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》
1、用*或*迅速將清洗的組織分離成適宜的小塊,如1cm^3
2、每體積濕重組織通常加3~5倍體積預(yù)冷的勻漿緩沖液至勻漿容器內(nèi)
3、制備勻漿:1)手動(dòng)的玻璃勻漿器勻漿10-20次。2)剪切式組織勻漿均質(zhì)以10000-28000rpm的速度,高速勻漿3次,每次10秒,次間暫停幾秒。3) 24多樣品研磨珠均質(zhì)儀以線速度6.5m/s,高速勻漿3次, 每次15秒 , 次間間隔10秒。
4、離心去上清,轉(zhuǎn)速可參照 3,000. rpm/15  minutes/4'C

5組織勻漿經(jīng)提取液提取后得到的應(yīng)是組織細(xì)胞的總蛋白質(zhì)

注意事項(xiàng):

避免血液影響:

1 充分放血 (找到頸動(dòng)脈或股動(dòng)脈,剪斷,放血會(huì)比較充分)。
2 對(duì)于血流較豐富的器官,比如肝臟,可用生理鹽水從肝門靜脈灌流沖洗。
3勻漿過程應(yīng)注意維持低溫,可外置冰水浴  Omni公司 兩款設(shè)備可選配冰槽 和Cryo 24多樣品研磨珠均質(zhì)儀冷卻單元

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