本試劑盒僅供研究使用。 
1 使用目的：：：： 
本試劑盒用于組織、飼料、牛奶、血清和尿樣中安定殘留的定量檢測。 
2 實(shí)驗(yàn)原理 
本試劑盒采用競爭 ELISA 方法，在微孔板包被有安定偶聯(lián)抗原，加入安定標(biāo)準(zhǔn)品或樣
品，游離安定與微孔條上預(yù)包被的安定偶聯(lián)抗原互相競爭抗安定抗體酶標(biāo)記物，用 TMB 底
物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下進(jìn)行檢測，吸光值
與樣品中安定含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中安定的含量。 
3 試劑盒組成 
3.1 預(yù)包被的安定偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。 
3.2 安定標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是：0 ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1 ppb 
3.3抗安定抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。 
3.4顯色液A：1瓶（6ml）。 
3.5顯色液B：1瓶（6ml）。 
3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。 
3.7*：1瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用。 
3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。 
3.9說明書一份。 
4 需要而未提供的材料 
4.1 設(shè)備 
4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。 
4.1.2粉碎機(jī)。 
4.1.3量筒。 
4.1.4振蕩器。 
4.1.5漏斗。 
4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙。 
4.1.7微量移液器。 
4.2 試劑 
4.2.1去離子水或蒸餾水。 
4.2.2 甲醇。 
5 貯存 
5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍 
5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存 
6 注意事項(xiàng) 
6.1 使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。 
6.2 不要使用過期試劑盒。 
6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。 
6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有安定，使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。  
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6.5 終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。 
6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗(yàn)結(jié)果。 
6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 
6.8 稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的*，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 
6.9 混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。 
7 工作液準(zhǔn)備 
7.1 安定標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0 ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1 ppb 
7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用 
7.3 *：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用 
7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照 
7.4 反應(yīng)終止液：已備用 
8 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則 樣品處理程序
會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存） 
8.1.1 牛奶 
脫脂奶：直接分析。 
全脂奶：13000g離心15分鐘，取上清液檢測（避免取到乳脂） 
8.1.2 肝臟： （稀釋倍數(shù)2） 
--稱取2g已絞碎的樣品到試管中。 
--加入14ml的乙腈，然后均質(zhì)（用20000rpm均質(zhì)幾分鐘）。 
--振蕩15分鐘，然后2500g離心15分鐘。 
--取上清液1ml到另一玻璃管中在40-50℃下蒸干（利用氮?dú)獯蹈蓛x或者旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器）。 
--加入250μl去離子水并漩渦混合。 
--溶液待測。 
8.1.3 雞蛋： （稀釋倍數(shù)2） 
--取2g樣品到試管中，加入6mL乙腈。 
--振蕩15分鐘，然后3000g離心15分鐘。 
--取上清液1ml到另一玻璃管中蒸干（40-50℃）。 
--加入500μl去離子水并漩渦混合。 
--溶液待測。 
8.1.4 蜂蜜： (稀釋倍數(shù)2) 
---取蜂蜜2g，置于離心管中（約15mL），加入4mL水溶解。 
--加入2ml 乙酸乙脂后，振蕩均勻。 
--然后3000rpm，離心15分鐘。 
--取上清液0.5ml置于萃取管中于水浴60℃下以氮?dú)獯蹈伞?nbsp;
--加入0.5ml去離子水混合，振蕩約10秒鐘。 
--取100μl 待測。 
推薦使用的其它樣品的前處理方法： 推薦使用的其它樣品的前處理方法：：： 
8.2.1 組織樣： （稀釋倍數(shù)1） 
--取3g絞碎樣品置入50ml離心管中。 
--加入6ml乙酸乙酯均質(zhì)。 
--以3000g離心10分鐘。 
--取2ml上清液置入10ml塞玻璃管中，于水浴50℃下以氮?dú)獯蹈伞?nbsp;
--于此玻璃管中加入2ml正己烷，振蕩混合。  
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--再加入1ml去離子水，振蕩混合約10秒鐘，以離心機(jī)3,000g離心10分鐘。 
--利用吸管吸去包含中間乳化層部分的上層液（正己烷層）； 
--取50μl待測。 
8.2.2 血清血漿： （稀釋倍數(shù)1） 
--移取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1分鐘。 
--室溫3000g離心10分鐘。 
--移取1ml上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?0 oC水浴中吹干。 
--殘留物用0.5ml去離子水溶解。 
--取100ul 待測。 
8.2.3 飼料樣品： （稀釋倍數(shù)4） 
--取1g飼料樣品(精細(xì)粉碎過的，有代表性的)，放入離心管中。 
--加4ml乙酸乙酯劇烈混合1分鐘（用可旋轉(zhuǎn)振蕩搖床） 
--室溫3000g離心10分鐘。 
--移取1ml上層的乙酸乙酯至另一試管中，60 oC氮?dú)饬飨抡舾伞?nbsp;
--用1ml異辛烷/氯仿混合物(2:3混合)溶解干燥的殘留物。 
--加入1ml去離子水強(qiáng)烈振蕩1分鐘。 
--室溫3000g離心10分鐘。 
--取100μl上層水相待測。 
8.2.4 尿液： （快速處理方法） 
--尿液不用處理，直接測定。（如果尿液渾濁，一定要過濾或離心） 
9 酶免分析步驟 
9.1 實(shí)驗(yàn)須知 
9.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)。回溫至室
溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存 
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的度和準(zhǔn)確度。 
9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存 
9.1.3 請不要改變分析程序 
9.1.4 請使用的微量移液器 
9.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序 
9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作 
9.1.7 為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣 
9.1.8 加樣時(shí)請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面 
9.2 分析步驟 
9.2.1 預(yù)*行編號，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測 
9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存 
9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（10×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋) 
9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液 
9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 
9.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液 
9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗安定抗體酶結(jié)合物 
9.2.8 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘。 
9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差） 
9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液
體。  
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9.4 反應(yīng) 
9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50μl顯色液A，再加 50μl顯
色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻 
9.4.2 37℃溫浴10min 
9.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻 
9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。 
10 結(jié)果計(jì)算 
10.1定量分析 
10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）
的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。 
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 
B0—0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 
10.1.2以安定濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸
光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為安定濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液
中安定濃度C（ppb） 
10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋
倍數(shù)。 
10.2 半定量測定 
10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光
度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。 
10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色
深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。 
11 特異性 
物質(zhì) 交叉反應(yīng) 
安定 100% 
 
12 試劑盒參數(shù) 
本試劑盒檢測下限為0.05ppb 
B0吸光度*值應(yīng)大于1.0 
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。 
用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。 
13 
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb。 
 
 
14 分析限制 
本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。