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一、勻漿介質
一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。
二、細胞樣本的前處理:
1、細胞沉淀的收集:
① 懸浮細胞: 對于懸浮培養(yǎng)的細胞,直接通過離心收集細胞沉淀,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉淀。
② 貼壁細胞: 對于貼壁培養(yǎng)的細胞,用*將細胞消化下來,或用細胞刮將細胞刮下來,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉淀。
我們一般建議客戶,細胞密度不要小于一百萬個/ml。
2、細胞沉淀的洗滌:
在細胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS (等滲), 輕輕顛倒混勻,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉淀。
重復上述操作反復洗滌1~2次。
3、勻漿的方式:手工勻漿,超聲破碎,裂解液裂解,反復凍融。
① 手工勻漿:在細胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,用移液器將細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中(2ml玻璃勻漿管),將玻璃勻漿管置于冰水混合物中,手動勻漿3分鐘,然后取破碎好的細胞懸浮液進行測定。
② 超聲破碎:
在細胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,在冰水浴條件下進行如下操作:
a、用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產超聲波發(fā)生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復3~5次。
b、用超聲細胞破碎儀,300W功率,每次超聲3~5秒,間隔30秒,重復4~5次。
③ 裂解液裂解
常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的,或者說作用力量強弱不同。
1、SDS屬于離子型去垢劑,zui厲害,基本可以把細胞*破掉,DNA會釋放出來,裂解液變得很粘稠。
2、NP-40是很溫和的去垢劑,1%濃度的基本可以破壞掉胞膜,而對核膜破壞的作用弱,結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。
3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間,偏向于NP40,也是常用的細胞裂解液成分之一,在保護蛋白活性方面有一定作用(SDS基本會使蛋白變性失活)。
去垢劑屬性只是一方面,buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關鍵因素
由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不*用裂解液進行裂解。
④ 反復凍融:
在細胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,放低溫冰箱中結冰,溶解,再結冰,再溶解,反復3次左右)。
由于反復凍融對酶活力影響較大,一般不*使用
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