酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISPOT）可以分解成“酶聯(lián)免疫"和“斑點(diǎn)"兩部分。“酶聯(lián)免疫"與ELISA中的含義相同，都是指基于酶促放大反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)。與ELISA一樣，ELISPOT的抗體也是包被于固體載體上，所不同的是：ELISA抗體捕獲的抗原來(lái)自樣品溶液中已經(jīng)存在的、均勻分布的抗原分子，而ELISAPOT抗體捕獲的抗原來(lái)自樣品細(xì)胞在檢測(cè)當(dāng)時(shí)新鮮分泌的抗原分子；ELISA顯示出來(lái)的是或深或淺的有色溶液，而ELISAPOT顯示出來(lái)的是沉積在固體基板上或多或少的有色斑點(diǎn)，這也是ELISPOT一詞中“斑點(diǎn)"的來(lái)歷。

    ELISA檢測(cè)的是無(wú)生命的溶液中抗原分子的濃度，ELISPOT檢測(cè)的是有生命的活細(xì)胞分泌抗原的功能。即將不同來(lái)源的一定量的細(xì)胞加至已包被抗細(xì)胞因子抗體的固相微孔板內(nèi)，同時(shí)加入細(xì)胞刺激劑，經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間，洗去細(xì)胞，再加入酶標(biāo)抗體，與被測(cè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子反應(yīng)，zui終通過(guò)ELISPOT檢測(cè)儀讀取斑點(diǎn)數(shù)。此法可測(cè)定一定屬靈的細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子的量。

試劑與器材

實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)器材：超凈工作臺(tái)、5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱等。

ELISPOT試劑盒：包括包被抗體、檢測(cè)抗體、親和素、封閉液、稀釋緩沖液R（10×）、Tween20、顯色液存儲(chǔ)液以及膠囊等。

Biosys Bioreader 4000 PRO自動(dòng)讀板儀。

P20，P200，P1000微量移液器及槍頭。

0.5ml及1.5ml Eppendorf管。

抗原或促有絲分裂原。

操作步驟

未包被板ELISPOT技術(shù)主要包括抗體包被、細(xì)胞加板和斑點(diǎn)顯色三大步驟。

一、抗體包被

1、潤(rùn)濕：在未包被ELISPOT板每孔中加入15μl包被緩沖液預(yù)濕。

2、包被：潤(rùn)濕之后，無(wú)需洗滌。每孔加入50μl PBS稀釋好的包被抗體（濃度為10μg/ml），4℃包被過(guò)夜。

3、封閉：次日傾倒包被液，用PBS洗滌2次。zui后一次，在滅菌的吸水紙上拍干。200μl/孔加入用1×PBS稀釋好的封閉液，37℃封閉1h或室溫封閉2h。

4、傾倒封閉液，無(wú)需洗滌，直接加入檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。

二、細(xì)胞加板

1、取出封閉好的板，準(zhǔn)備加入細(xì)胞。如果是以前封閉的板，先加入200μl RPMI-1640培養(yǎng)基室溫靜置10min，然后傾倒。

2、細(xì)胞加板：按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，接種不同濃度的細(xì)胞，100μl/孔，每一樣本建議做雙復(fù)孔。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

3、加刺激物：把刺激物配成10×工作液，實(shí)驗(yàn)孔每孔加入10μl。陽(yáng)性對(duì)照孔加入10μl PHA，終濃度1-4μg/ml，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌。陰性對(duì)照孔不加任何刺激物。

4、加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱看，37℃培養(yǎng) 18-24h。

注意以上步驟均應(yīng)無(wú)菌操作

三、斑點(diǎn)顯色

1、裂解細(xì)胞：傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基，每孔加入冰冷的去離子水200μl，4℃ 冰浴10min（低滲裂解細(xì)胞）。

2、洗滌：每孔加入200μl PBST，洗滌5次，zui后一次，在吸水紙上扣干。

3、加檢測(cè)抗體：每孔加入100μl稀釋好的*標(biāo)記檢測(cè)抗體，37℃孵育1h。

4、同2進(jìn)行洗滌。

5、加酶標(biāo)親和素：每孔加入100μl稀釋好的酶標(biāo)親和素，37℃孵育1h。

6、同2進(jìn)行洗滌。

7、顯色：用100ml 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊，然后加入3.3ml AEC儲(chǔ)存液，混合均勻后立即分裝，每支10ml，-20℃保存。每孔加入100μl的顯色液，室溫或者37℃ 靜置15-45min（在20-25℃顯色25min或者37℃顯色15min較合適），注意避光。

8、洗滌晾干：待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到合適的大小之后，以去離子水洗滌2編，終止顯色過(guò)程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后去下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干。注意不要將板放在烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂。

9、將ELISPOT板置于Biosys Bioreader 4000 PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)，做統(tǒng)計(jì)分析。

注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞加入前應(yīng)*洗干凈，避免帶入外源性細(xì)胞因子。

2、加板時(shí)細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻，要訣是加入細(xì)胞之后，不要再振動(dòng)或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞更分散，實(shí)際情況恰恰相反。同樣加完刺激物后也不要在拍擊ELISPOT板。

3、ELISPOT是通過(guò)計(jì)數(shù)形成的斑點(diǎn)數(shù)來(lái)判定結(jié)果，斑點(diǎn)數(shù)的多少應(yīng)該能真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)對(duì)象的客觀情況。為了使實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，斑點(diǎn)數(shù)目不宜太少；但為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果便于計(jì)數(shù)，斑點(diǎn)數(shù)目也不宜太多。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)孔的斑點(diǎn)數(shù)目。而對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)目應(yīng)該越少越好，不要超過(guò)10ge，否則要提高檢測(cè)細(xì)胞的質(zhì)量，讓細(xì)胞保持較好的狀態(tài)與活力。