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細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)---瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

時間:2015-5-7閱讀:363
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    細(xì)胞常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(*轉(zhuǎn)染)。

    瞬時轉(zhuǎn)染(transient transfection)是將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方式之一。在瞬時轉(zhuǎn)染中,重組DNA導(dǎo)入感染性強的細(xì)胞系以獲得目的基因暫時但高水平的表達(dá)。轉(zhuǎn)染的DNA不必整合到宿主染色體,可在比穩(wěn)定轉(zhuǎn)染較短時間內(nèi)收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,并對溶解產(chǎn)物中目的基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(*轉(zhuǎn)染)是用于建立克隆的細(xì)胞系,這種細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染的目的基因整合到染色體DNA中并指導(dǎo)適量目的蛋白的合成。一般來說(由細(xì)胞類型決定),形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率比瞬時轉(zhuǎn)染(transient transfection)的效率低1到2個數(shù)量級。利用可選擇的遺傳標(biāo)記物有利于從非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的中分離出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物。

    前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72 小時內(nèi)(依賴于各種不同的構(gòu)建)分析結(jié)果,常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白,β 半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA 既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在。盡管線性DNA 比超螺旋DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。 外源DNA 整合到染色體中概率很小,大約1/104 轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合,通常需要通過一些選擇性標(biāo)記,如氨丙基轉(zhuǎn)移(APH;*抗性基因),潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大,許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例,細(xì)胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測 時間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù),如DEAE 右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質(zhì)體法各有利弊。







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