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時間：2021-3-23閱讀：1194

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作為一只廢寢忘食的實驗狗走過的路不是來自四面八方的套路而是通向?qū)嶒灣晒Φ?/font>“彎路”

ELISA實驗步驟少,流程短,購買的ELISA試劑盒也都有指導(dǎo)性很強的操作說明書，單次實驗3-6小時即可得到結(jié)果,實驗小白也可以很快的上手。但是，各位同學(xué)可不要這樣就輕視哦~，ELISA和WB、IHC等基礎(chǔ)免疫實驗一樣，都是易學(xué)難精，上手容易，但想要得到穩(wěn)定的結(jié)果，不好好做些準(zhǔn)備可是不行的哦~

 

夾心法ELISA實驗中的捕獲抗體和檢測抗體是同一個抗體么?

不是的，在雙抗夾心法ELISA實驗中，會同時用到捕獲抗體和檢測抗體，這兩個抗體是針對同一抗原蛋白的不同抗原位點的兩種抗體，這樣才可以同時結(jié)合抗原分子。這也是雙抗夾心法ELISA不適用與小分子抗原和半抗原等待測指標(biāo)的原因。

 

 后面顯示的OD值在多少之間屬于可用值，有要求嗎?

有的,建議標(biāo)準(zhǔn)曲線越高濃度 點的OD值在2.0左右較好,也可參考說明書標(biāo)曲的數(shù)據(jù)。

 

標(biāo)準(zhǔn)曲線在推選的濃度下，r2值為0.9，做了多次都是這樣，怎么辦?

這種情況首先要仔細(xì)核對產(chǎn)品說明書,看是否用了推選的擬合方法,如紀(jì)寧生物的ELISA試劑盒,需要使用直線、二項式、四參數(shù)擬臺方式進行擬合，用錯擬合方式,會導(dǎo)致r2值較低;如擬合方式無誤，需檢查是否有個別標(biāo)曲孔數(shù)值異常,排查實驗過程中是否出現(xiàn)污染或標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋時出現(xiàn)失誤，導(dǎo)致加樣不準(zhǔn)。

 

副孔差別比較大，是沒洗干凈嗎?

復(fù)孔值差異較大，主要原因應(yīng)考慮加樣是否準(zhǔn)確,洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。加樣應(yīng)注意移液器量程,以及槍頭殘留問題;洗板過程應(yīng)注意不要有殘留液體，需要進行拍干操作;孵育過程要更換封板膜,拍干過程要換吸水紙，避免交叉污染。

 

ELISA可以檢測胞內(nèi)蛋白么?

可以的，大部分ELISA指標(biāo)均為炎癥因子、趨化因子等分泌類型蛋白，支持的樣本類型也多為血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等液體樣本。如需檢測胞內(nèi)蛋白,首先需要確認(rèn)待測指標(biāo)是否在胞內(nèi)表達,然后選用支持組織勻漿樣本的ELISA試劑盒即可,將組織樣品或細(xì)胞樣品進行裂解,提取胞內(nèi)蛋白后進行蛋白定量,保證每孔上樣總蛋白量一致即可。

 

同一樣品多次ELISA檢測，測試結(jié)果差異大怎么解決?

應(yīng)考慮的問題包括:

●樣本保存不當(dāng)，會導(dǎo)致多次實驗結(jié)果偏差較大,樣本應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融，如需多次檢測，需在取樣后分裝保存;

●樣品凍融之后未混勻，應(yīng)混勻后再上樣;

●加樣不準(zhǔn)確，微量樣品加樣時要注意移液器槍頭不要有殘留。

 

檢測樣本是細(xì)胞培養(yǎng)上清，那么細(xì)胞數(shù)目對炎癥因子的濃度有影響嗎?

有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)水平接近一致。 因不同處理， 可能會導(dǎo)致細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)不同，要保證在鋪板時接種細(xì)胞數(shù)量水平一致。

 

整個過程需要避光嗎?避光需要避到什么程度呢?

ELISA實驗中。在酶標(biāo)抗體孵育, 以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無需避光。避光可采用封板膜覆蓋, 或?qū)⒄麄€ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。

 

封板膜什么時候用?每次加液后都要換嗎?

封板膜在孵育樣品、檢測抗體以及HRP酶標(biāo)抗體時，都要蓋好封板膜, 減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。

 

ELISA實驗中的洗板步驟如果沒有洗板機，需要如何操作?

實驗室ELISA實驗做的較多,還是建議使用洗板機洗板,效果更好,也更方便控制。如果沒有洗板機，在洗板過程中,需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出, 在加洗板液后, 靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干;重復(fù)三次。

 

配好的抗體沒用完如何保存，可保存多久?預(yù)實驗用了一個試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實驗嗎?

針對紀(jì)寧生物的ELISA試劑盒來講,在說明書中有各組分拆開后的保質(zhì)期， 配好的母液和拆封的板子，可以在四度保存,保質(zhì)期為一個月左右。剩下的板子和試劑在保質(zhì)期內(nèi)是可以繼續(xù)用于正式實驗的，為保證實驗質(zhì)量, 還是建議間隔時間不要太長，一周之內(nèi)更好,需注意試劑避免污染，板子保持干燥。

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