線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ_氧化磷酸化系列
測(cè)定方法：分光光度法
產(chǎn)品規(guī)格：25管/24樣
注 意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞-色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞-色素C的氧化，并終把電子傳遞給氧，生成水。
線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ_氧化磷酸化系列
測(cè)定原理：
還原型細(xì)胞-色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞-色素C生成氧化型細(xì)胞-色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二： 5mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存；
試劑四：液體10mL×2瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×2支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×2支，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g，4℃離心5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）。
5、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）工作液的配制：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
（2）將工作液置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；
（3）在1mL玻璃比色皿中加入80μL樣本和800μL工作液，混勻，記錄550nm處初始吸光值A(chǔ)1和 37℃反應(yīng)30min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意點(diǎn)：
1、若ΔA大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），使A1-A2小于0.2，可提高檢測(cè)靈敏度。
2、動(dòng)物肝臟樣本由于酶活性過(guò)高， 1分鐘內(nèi)吸光值就會(huì)到達(dá)平臺(tái)期，務(wù)必先進(jìn)行2個(gè)樣本的預(yù)測(cè)定?？蓪颖居迷噭┒♂?0~50倍，反應(yīng)時(shí)間縮到到30秒或1分鐘（計(jì)算公式中代入實(shí)際反應(yīng)時(shí)間，并乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）。其他樣本可按照正常測(cè)定步驟進(jìn)行。
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