ELISA試劑盒操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準品在相同的條件下制作標(biāo)準曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA試劑盒，標(biāo)準曲線的范圍一般較寬，曲線zui高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，*較呈直線的部分是的檢測區(qū)域。甲胎蛋白質(zhì)示例見圖4-1。
測定小分子量物質(zhì)常用競爭法（參見2.2），其標(biāo)準曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關(guān)。標(biāo)準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA試劑盒測定的標(biāo)準曲線示例見圖4-2。注意圖中橫坐標(biāo)為對數(shù)關(guān)系，這更有利于測定系統(tǒng)的表達。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中一夜，以形成zui多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。
保溫的方式除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA試劑盒板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA試劑盒板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA試劑盒放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA試劑盒板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
