不同相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離—凝膠柱層析法
目的要求
（1）、了解凝膠柱層析的原理及應(yīng)用
（2）、掌握凝膠柱層析的基本操作技術(shù)
實(shí)驗(yàn)原理
凝膠層析又稱凝膠過(guò)濾，是一種按相對(duì)分子質(zhì)量大小分流物質(zhì)的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖液洗脫。大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒中的靜止相中，只留在凝膠顆粒之間的流動(dòng)相中，因此比較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，并很快在流動(dòng)相和靜止相之間形成動(dòng)態(tài)平衡，因此，就要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間流經(jīng)柱床，從而使不同大小的分子得以分離。
凝膠過(guò)濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以*或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對(duì)某些小分子化合物則不能排阻，可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數(shù)Kav表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)。
在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值卻是隨著分離物相對(duì)分子質(zhì)量的變化而變化的。分離物相對(duì)分子質(zhì)量大，Kav值小；反之則Kav值增大。
通常選用藍(lán)色葡聚糖2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。該物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大，呈藍(lán)色，它在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被*排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測(cè)。但是，在測(cè)定激酶等蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量時(shí)，不宜用藍(lán)色葡聚糖2000測(cè)定外水體積，因?yàn)樗鼘?duì)激酶有吸附作用，所以有時(shí)用巨球蛋白代替。測(cè)定內(nèi)水體積（Vt）的物質(zhì)，可選用硫酸銨、N-乙酰*乙酯，或者其他與凝膠無(wú)吸附力的小分子物質(zhì)。
本實(shí)驗(yàn)使用血紅蛋白和二硝基氟苯—*的混合物，通過(guò)Sephadex G-25層析后達(dá)到分離。
試劑和器材
（1）、試劑
0.9%NaCI；10%NaHCO3；95%乙醇。pH7.0凝酸緩沖液。
（2）、材料
血紅蛋白溶液（Hb）；取抗凝血（肝素）2mL，離心棄去上層血漿。用0.9%NaCI洗血細(xì)胞數(shù)次，使離心后上清液幾乎無(wú)淡黃色為止。于洗凈的紅細(xì)胞中加入5倍體積的蒸餾水搖勻，離心去沉淀即為Hb稀釋液備用。
DNP-*溶液：取*0.15g溶于10%NaHCO3溶液1.5mL中。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微熱的95%乙醇3mL中，待其充分溶解后立即傾入上述蛋白質(zhì)溶液中。將此管置于沸水浴中煮沸5min，注意防止乙醇沸騰溢出。冷卻后加2倍體積的95%乙醇，可見(jiàn)黃色的DNP-*沉淀。離心(300r/m)5min,棄去上清液，沉淀用95%乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸餾水溶解，即為DNP-*溶液，備用。
（3）、器材
層析柱（1cm×15cm）；吸管1mL（×1）；滴管；攪棒試管。
操作方法
（1）、凝膠的溶脹
取3g葡聚糖凝膠干粉，浸泡于蒸餾水中充分溶脹，或者于沸水浴中煮沸1h后冷卻。充分溶脹后的凝膠以傾斜洗除去表面懸浮的小顆粒，如此反復(fù)洗滌2～3次，zui后加入等體積pH7.0磷酸緩沖液備用。
（2）、裝住
取直徑1cm，長(zhǎng)15cm的玻璃層析柱，垂直固定在鐵架臺(tái)上，將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入5～7cm高的磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)流速1滴/10s。待柱中剩下約0.5cm磷酸緩沖液時(shí)，關(guān)掉恒流泵，把溶脹好的糊狀凝膠一次性倒入柱中，自然沉降20min。在此過(guò)程中可以看到凝膠均勻地沉降到柱的底部并不斷地上升。20min后，用鑷子小心地在膠面上放置圓片濾紙，用滴管補(bǔ)加緩沖液。同時(shí)開(kāi)啟恒流泵，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。若分次裝入凝膠，需要玻璃棒輕輕攪動(dòng)柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面分層。裝柱長(zhǎng)度至少10cm。
（3）、平衡
用磷酸緩沖液沖洗洗脫，平衡20min。注意在任何時(shí)候不要使液面低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)。
（4）、樣品制備
取DNP-*溶液3滴和Hb溶液1滴混合，即為上柱樣品。
（5）、上樣
待層析柱上緩沖液幾乎全部進(jìn)入凝膠時(shí)，關(guān)掉恒流泵，用滴管將上述樣品沿柱內(nèi)壁小心加到床表面，注意盡量不使平整的床表面攪動(dòng)，然后打開(kāi)恒流泵，讓樣品進(jìn)入柱床。待其將進(jìn)入柱床時(shí)，關(guān)掉恒流泵，用滴管小心加入磷酸緩沖液至柱頂。
（6）、洗脫
旋緊柱頂，將進(jìn)液管接入洗脫液瓶中，用緩沖液進(jìn)行洗脫，控制緩沖液在約每10s一滴的流速，觀察并記錄Hb和DNP-*在層析柱中的位置，并解釋之。
待所有有色條帶*流出柱子后，繼續(xù)洗柱5min。停止恒流泵，卸下柱子，旋下柱頂螺旋，將凝膠倒回小燒杯中并取出濾紙片。
注意事項(xiàng)
（1）、根據(jù)層析柱的溶劑和所選用的凝膠溶脹后柱床容積，計(jì)算所需凝膠干粉的重量，用洗脫緩沖液使其充分溶脹。
（2）、層析柱粗細(xì)必須均勻，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)長(zhǎng)的柱分離效果較好。若樣品量多，選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時(shí)分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時(shí)，會(huì)發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱管中心部分的組分移動(dòng)慢，而管壁周圍的移動(dòng)快。柱越長(zhǎng)，分離效果越好，但柱過(guò)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。
（3）、各接頭不漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則容易造成漏氣、漏液。
（4）、裝柱要均勻，不要過(guò)松也不要過(guò)緊，也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過(guò)快，避免因此而壓緊凝膠。但也不要過(guò)慢，使柱裝的太松，導(dǎo)致層析過(guò)程中，凝膠床高度下降。
（5）、始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。
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