染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與總蛋白含量
一、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)
Darzynkiewicz和他的同事們用流式細胞術作了大量染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的工作。他們首先用RNA酶處理細胞，除去RNA，然后用酸變性或者熱變性等方法使DNA部分變性。變性的部分由雙鏈變成單鏈。AO標記后，凡是已變性的單鏈核酸由發(fā)綠色熒光變成發(fā)紅色熒光，所以紅色熒光的強度說明染色質(zhì)變性的程度。由于細胞周期各時相中，染色質(zhì)的凝集程度不同，經(jīng)酸或熱處理后，變性程度也不同，染色質(zhì)越凝集，對酸和熱變性越敏感。他們用這種方法區(qū)分出了細胞周期各時相如G0、G1、S、G2和M期細胞。
AO酸變性的程序為：首先配制AO貯液、A液和B液。AO貯液濃度為1mg/ml，在蒸餾水中；A液由0.1MHCI和0.1MKCI組成，pH1.4；B液由8ug/ml AO、0.2M、Na2HPO4和0.1M檸檬酸組成，pH2.6。
以70%冷乙醇在4℃固定細胞至少12小時，離心洗細胞后，將細胞沉淀重新懸浮在PBS緩沖液中（pH7.4），細胞濃度為106細胞/ml。在室溫下，取0.2ml細胞，加入0.5ml A液，30秒后立即加入2ml B液，染色2至10分鐘，立即進行流式分析。
二、總蛋白含量
測定總蛋白含量能夠檢測一個細胞群體生長和代謝的狀態(tài)，也可以區(qū)別具有不同蛋白含量的細胞亞群，如血液中的白血細胞。
FITC（Fluorescein isothiocyanate，異硫氰基熒光素）是檢測總蛋白zui常用的熒光探針。它是酸性染料，以共價鍵方式結(jié)合到蛋白的帶有正電荷的基上，以藍光激發(fā)后，發(fā)出明亮的綠色熒光。
FITC的貯液以濃度1mg/ml制備在純乙醇中，使用時用PBS（pH7.4）稀釋成所需工作液。FITC和PI對固定細胞的總蛋白和DNA雙染的方法是：將固定的細胞懸浮在含有18ug/ml pI，0.05ug/mI FITC和40ug/ml RNase的PBS液中，室溫下至少染20分鐘后，進行流式分析。
FITC不能穿過活細胞的膜，若丹明640（Rhodamine 640）能對活細胞的蛋白進行染色，使用濃度為1—5ug/ml，若丹明640zui大激發(fā)峰為582nm，zui大發(fā)射峰為601nm。
