酵母RNA的提取及組分鑒定
目的要求
（1）、了解并掌握稀堿法提取RNA的原理和方法。
（2）、了解核酸的組分并掌握其鑒定方法
實(shí)驗(yàn)原理
由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也很各異。一般有*發(fā)、去污劑法和鹽酸胍法。其中*法又是實(shí)驗(yàn)是zui常用的。組織勻漿用*處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中。向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去RNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這兩種方法所提取的核酸均勻變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡單。濃鹽法使用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取3～4h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法使用稀堿使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。
酵母含RNA達(dá)2.67%～10.0%，而DNA含量僅為0.03%～0.516%。為此，提取RNA多以酵母為原料。
RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮可使RNA水解，從水解液中可用定糖，定磷和加銀沉淀等方法測出上述組分的存在。
試劑和器材
1、試劑
0.04mol/L，NaOH溶液；95%乙醇；1.5mol/L硫酸；濃氨水；0.1mol/L*。酸性乙醇溶液；30mL乙醇加0.3mLHC1。
三氯化鐵農(nóng)鹽溶液；將2mL，10%二氯化鐵溶液加入400mL濃HC1。
苔黑酚乙醇溶液：稱取6g苔黑酚溶于95%乙醇100mL。
定磷試劑：
17%硫酸：將17mL，濃硫酸緩緩傾入83mL水中。
2.5%鉬酸銨：2.5g鉬酸銨溶于100mL水中。
10%抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶于100mL水中，置于棕色瓶中并保存溶液。
臨用時(shí)將三種溶液和水按下列比例混合：
17%硫酸：2.5%鉬酸銨：10%抗壞血酸：水=1:1:1:2（V/V）
2）、材料
*粉
3）、器材
移液管0.2mL（×1），2.0mL（×1），1mL（×4）；量筒10mL（×1），50mL（×1）；滴管；水浴鍋；離心機(jī)。
操作方法
1、酵母DNA提取
稱5g*粉懸浮于30mL，0.04mol/L，NaOH溶液中 并在研缽中研磨均勻。懸浮液轉(zhuǎn)入三角燒瓶，沸水浴加熱30min，冷卻，轉(zhuǎn)入離心管。3000r/min，離心15min后，將上清慢慢傾入10mL酸性乙醇，邊加邊攪動。加畢，靜置，待RNA沉淀*后，3000r/min離心3min。棄去上清液。用95%乙醇洗滌沉淀兩次。再用乙醚洗滌沉淀一次后，用乙醚將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾。沉淀在空氣中干燥。
2、RNA組分鑒定
取2g提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸10mL，沸水浴加熱10min制成水解液，然后進(jìn)行組分鑒定。
（1）、嘌呤堿。取水解液1mL加入過量濃氨水。然后加入1mL ，0.1mol/L*溶液，觀察有無嘌呤堿銀化合物沉淀。
（2）、核糖。取水解液1mL，三氯化濃鹽酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意觀察核糖是否變成綠色。
（3）、磷酸。取水解液1mL，加定磷試劑1mL。在水浴中加熱觀察溶液是否變成藍(lán)色。
會員1.png)