生物細胞對于培養(yǎng)細胞樣品
1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
2. 對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗）。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。
對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。
3. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等生物細胞對于培養(yǎng)細胞樣品操作。
裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200微升或250微升。
對于組織樣品：
1. 把*切成細小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。）
4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等生物細胞對于培養(yǎng)細胞樣品操作。
6. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。