大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗
實驗方法原理 質(zhì)粒DNA或重組DNA粘附在細菌細胞表面，經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。
實驗材料 質(zhì)粒DNA重組DNA
試劑、試劑盒 LB培養(yǎng)基蒸餾水IPTGX-gal氨芐*
儀器、耗材 旋渦混合器微量移液取樣器移液器吸頭 離心管雙面微量離心管架干式恒溫氣浴恒溫水浴鍋制冰機恒溫搖床培養(yǎng)皿超凈工作臺酒精燈玻璃涂棒恒溫培養(yǎng)箱
實驗步驟
一、實驗材料準備
1. 器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，恒溫搖床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。
2. 試劑
培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。
3. 材料處理
無菌ddH2O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
二、操作步驟
1. 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。
2. 從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100 μl）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
3. 加入5 μl 連接好的質(zhì)粒混合液（DNA含量不超過100 ng），輕輕震蕩后放置冰上20 min。
4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5 min。
5. 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 μl LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。
6. 在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液100-300 μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
7. 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
8. 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱。
9. 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。
10. 觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。
收起
注意事項
1. 玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂。
實驗材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 CaCl2氨芐*LB
儀器、耗材 離心機分光光度計搖床
實驗步驟
1. 接種—個單菌落于50 ml LB培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)過（250 r/min）。
2. 往一個2 L 的燒瓶中加入400 ml LB培養(yǎng)液，再加入4 ml 過培養(yǎng)液，于37℃；搖床，培養(yǎng)至OD590為0.375。
3. 將培養(yǎng)液分裝到8個50 ml 預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 離心7 min。
4. 細胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2“溶液重懸，于4℃，以1 100 g 離心5 min 。
5. 細胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 離心5 min。
6. 用2 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸各管細胞，然后按每管250 μl 的量分裝于預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于- 70℃。
7. 按照以下各步驟用10 ng pBR322轉(zhuǎn)化100 μl 感受態(tài)細菌。
8. 將合適體積的轉(zhuǎn)化物涂于含有氨芐*的LB平板上，37℃培養(yǎng)過。
9. 將10 ng 加入到一個15 ml 無菌的圓底試管中，并放置冰上。
10. 將盛有感受態(tài)細胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。
11. 立即將100 μl 感受態(tài)細菌加 入到管中，輕輕旋動，并放置冰上10 min 。
12. 將管故入42℃水浴2 min 進行熱休克，然后加入1 ml LB 培養(yǎng)液于每一支試管中。
13. 于37℃置滾筒式搖床口培養(yǎng)1 h。
14. 將幾個稀釋度菌液涂布于含合適抗生素的平板上，于37℃培養(yǎng)12~16 h。
