應(yīng)用優(yōu)勢
■ 使用更快的孔內(nèi)分析方式，更簡潔的單步提取法進(jìn)行DBS提取
■ 去除99.9%磷脂
■ 消除磷脂在LC色譜柱中的蓄積，提升方法穩(wěn)定性
沃特世解決方案
Xevo? TQ-S MS系統(tǒng)
ACQUITY UPLC?BEH C18柱
Ostro? 96孔樣品制備板
引言
干血斑分析法(DBS)在醫(yī)藥行業(yè)正變得愈發(fā)重要。動物實驗所帶來的經(jīng)濟(jì)及倫理道德方面的問題，以及在運(yùn)輸以及儲存生物樣品時所產(chǎn)生的高額費用問題，都使得DBS分析法成為一種頗具吸引力的選擇。DBS分析法可取得較高的分析物回收率。然而，該技術(shù)在去除內(nèi)源性干擾方面收效甚微。以殘余磷脂(PLs)為主的干擾物是生物分析中遇到的主要問題。而LC/MS/MS系統(tǒng)中PLs的蓄積，則是引發(fā)基質(zhì)效應(yīng)的主要原因。在所有其他問題之中，基質(zhì)效應(yīng)會以無可預(yù)測的方式影響質(zhì)譜響應(yīng)值，降低分析方法穩(wěn)定性并增加其可變性。Ostro 96孔樣品制備板則可消除99%以上的PLs殘留。Ostro 96孔板可通過使用96孔制備板的形式進(jìn)一步簡化DBS萃取流程，同時提取分析物、去除磷脂、過濾干血斑紙片。DBS樣品可在孔內(nèi)萃取并稀釋直接進(jìn)樣到LC/MS/MS系統(tǒng)中。該創(chuàng)新方法能夠顯著降低樣品制備時間，并在萃取轉(zhuǎn)化、干燥、復(fù)溶過程中避免潛在的分析物流失。在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們同時應(yīng)用了傳統(tǒng)方法和Ostro 96孔樣品制備板方法，對含有*、*羥基化代謝物、9-OH*及其內(nèi)標(biāo)*(圖1)的全血樣品進(jìn)行了萃取。
采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度
實驗部分
ACQUITY UPLC條件
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×50 mm，1.7 μm
流動相A： 0.1% NH4OH 水溶液
流動相B： 50/50 ACN/MeOH
流速： 0.6 mL/min
梯度：
時間 梯度模式 梯度線型
(min) %A %B
0.0 75 25 6
2.0 0.5 99.5 6
3.0 0.5 99.5 6
3.1 75 25 6
3.5 75 25 6
進(jìn)樣量： 40 μL
進(jìn)樣模式： 部分環(huán)進(jìn)樣
柱溫： 35 ℃
樣品溫度： 15 ℃
強(qiáng)洗針液： 60:40 ACN:IPA+2% HCOOH
弱洗針液： 95/5 H2O/MeOH
沃特世Xevo TQ-S MS運(yùn)行條件，ESI+
毛細(xì)管電壓： 3.0 V
脫溶劑溫度： 550 ℃
錐孔氣流速： 150 L/Hr
脫溶劑氣流速： 1000 L/Hr
碰撞池壓力： 2.6×10(-3) mbar
MRM通道監(jiān)測，ESI+參見表1
采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度
樣品制備條件
將20 μL的全血樣品滴在未經(jīng)處理的Whatman DMPK-C血卡上。樣品隨后在室溫下干燥2小時。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm血斑，分別放置進(jìn)傳統(tǒng)型DBS萃取法所需的1.5 mL離心管和Ostro 96孔板孔中。傳統(tǒng)萃取方法在1.5 mL離心管中進(jìn)行，使用了250 μL含5%水的甲醇溶液，隨后樣品進(jìn)行1分鐘渦旋、1分鐘3000 g離心，并zui終將萃取物轉(zhuǎn)移至96孔板上。使用Ostro 96孔板的萃取則采用單步孔內(nèi)萃取法。在Ostro 96孔板中添加3 mm干血斑(圖2)。以250 μL含5%水的甲醇溶液作為萃取溶液，渦旋操作1分鐘、真空操作5分鐘。兩種方法產(chǎn)生的洗脫液都用250 μL 的水進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)樣到LC/MS/MS系統(tǒng)中。
采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度
結(jié)果與討論
在正離子模式下進(jìn)行MS分析。鑒于DBS萃取物的直接進(jìn)樣通常會導(dǎo)稀釋的樣品，我們采用Xevo TQ-S以顯著提升系統(tǒng)的靈敏度。這同時也有助于直接進(jìn)樣，并避免了吹干、復(fù)溶過程中可能存在的問題。
針對每一種樣品制備方法，我們都比較了磷脂殘留量。為了達(dá)成這一目的，我們對單個試管萃取和使用Ostro PLR板孔內(nèi)萃取的DBS進(jìn)行了比對，對五種磷脂進(jìn)行了量化。與傳統(tǒng)型DBS分析法相比，Ostro板去除磷脂比例高達(dá)99.9%(圖3)。為能直觀展示殘余磷脂，傳統(tǒng)型DBS萃取法和使用Ostro的孔內(nèi)DBS萃取法所產(chǎn)生的五種不同磷脂的總離子流(TIC)如圖所示(圖4)。當(dāng)使用Ostro板時，磷脂殘留量幾乎可忽略不計，且無蓄積情況。而當(dāng)使用傳統(tǒng)型DBS法時，即便出于預(yù)防磷脂蓄積的目的，采用高比例有機(jī)溶劑進(jìn)行了1分鐘的清洗，磷脂殘余量依舊顯著，而且在整個過程中都有蓄積。我們進(jìn)行了半驗證，計算QC樣品濃度不足預(yù)期值的15%，滿足法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。9-OH*(圖6)及其母化合物L(fēng)LOQ在全血中都達(dá)到 0.05 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線在3個以上數(shù)量級呈線性，全血中的線性范圍從0.05 ng/mL到50 ng/mL(圖7)。
采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度
采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度
采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度
采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度
采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度
結(jié)論
■ 簡便、單步的DBS樣品制備方法
■ 相較于傳統(tǒng)的DBS萃取技術(shù)，去除殘余磷脂含量高達(dá)99.9%
■ 采用Xevo TQ-S質(zhì)譜儀，獲得高靈敏度
■ 去除LC色譜柱中PLs的蓄積
