實(shí)驗方法原理 在基因工程操作中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是一項基本技術(shù)。感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。農(nóng)桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生。將正在生長的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞迅速冷凍于-70℃可保存相當(dāng)一段時間而不會對其轉(zhuǎn)化效率有太大的影響。
實(shí)驗材料 土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株
試劑、試劑盒 YEB液體培養(yǎng)基酵母提取物牛肉膏蛋白胨蔗糖*氯化鈣*儲液
儀器、耗材 超凈工作臺恒溫?fù)u床冷凍高速離心機(jī)高壓滅菌鍋冰箱超低溫冰柜分光光度計接種針試管離心管離心管冰浴微量進(jìn)樣器吸頭
實(shí)驗步驟
一、實(shí)驗儀器、材料和試劑
1. 儀器
超凈工作臺，恒溫?fù)u床，冷凍高速離心機(jī)，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰柜，分光光度計，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進(jìn)樣器及吸頭。
以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。
2. 材料
土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株或其它農(nóng)桿菌菌株
3. 試劑
（1）YEB液體培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，高壓滅菌。
（2）*（Rif）儲液：50 mg/ml
（3）20 mM CaCl2，高壓滅菌。
二、實(shí)驗步驟
1. 挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養(yǎng)。
2. 取培養(yǎng)菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5。
3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。
4、加入1000 μl 20 mM CaCl2，使農(nóng)桿菌細(xì)胞充分懸浮，冰浴30 min。
5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 μl預(yù)冷的20 mM CaCl2，充分懸浮細(xì)胞，冰浴中保存，24 hr內(nèi)使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存?zhèn)溆谩?br>
電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)
實(shí)驗材料 農(nóng)桿菌菌種
試劑、試劑盒 HEPESNaOH*甘油
儀器、耗材 離心管離心機(jī)制冰機(jī)
實(shí)驗步驟
一、試劑配制
1 mM HEPES的配制：稱取0.119 g HEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500 ml，用NaOH調(diào)pH至7.0，滅菌后待用。
二、實(shí)驗步驟
1. 挑取單克隆接種于2 ml YEP（含50 mg/l*）液體培養(yǎng)基，28℃，250 rpm，振蕩培養(yǎng)。（如用5 mlYEP，需培養(yǎng)36 h）
2. 將菌液按1:100轉(zhuǎn)移至200 ml YEP（含50 mg/l*）培養(yǎng)液中，28℃，250 rpm，振蕩培養(yǎng)至OD=0.3(約4~5 h)。
3. 轉(zhuǎn)入50 ml的無菌離心管，4℃，4 000 rpm離心10 min，棄上清。
4. 用20 ml冰浴的HEPES(1 mM，PH7.0)重懸。
5. 4℃，4 000 rpm離心10 min，棄上清。
6. 重復(fù)4、5步驟2~3次。
7. 用2 ml冰浴的10%甘油重懸。
8. 每管100 μl分裝于1.5 ml無菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
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