實驗方法原理
細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。
實驗材料 細(xì)胞
試劑、試劑盒 D-Hanks液小牛血清培養(yǎng)液***HClNaHCO3DMSO甘油
儀器、耗材 微量加樣槍吸頭離心管凍存管槍頭膠塞移液管玻璃瓶紅血球計數(shù)板記號筆*移液槍超凈工作臺離心機恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱液氮冰箱
實驗步驟
一、材料準(zhǔn)備
1. 儀器：凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。
2. 玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。
3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。
4. 其他物品：微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、*、移液槍。
5. 試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（*、*）、*（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。
二、細(xì)胞凍存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。
2. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用*把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。
3. 離心1 000 rpm，5 min。
4. 去除*及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5×106/ml～1×107/ml。
5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。
6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者。
7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
三、 細(xì)胞復(fù)蘇
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。
3. 離心， 1 000 rpm，5 min。
4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
收起
注意事項
1. 從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。
2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。
3. 凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。
其他
一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
二、慢凍程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器
當(dāng)溫度在-25 ℃以上時， 1~2 ℃/min；
當(dāng)溫度達-25 ℃以下時， 5~10 ℃/min；
當(dāng)溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。
2. 簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面，次晨投人液氮中。
3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽長期儲存。
三、低溫保護劑的應(yīng)用
在細(xì)胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。
四、細(xì)胞凍存方法
1. 預(yù)先配制凍存液
（1）10%DMSO + 細(xì)胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
（2）10%甘油+ 細(xì)胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
2. 取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)*消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml）。
3. 加入1 ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。
五、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法
1. 快速解凍
凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。
2. 解凍后的細(xì)胞可直接接種到含*生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。
3. 如果細(xì)胞對冷凍保護劑特別敏感
解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
