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閱讀:240發(fā)布時間:2015-6-10
多種酶消化
實驗材料 DNA
試劑、試劑盒 限制酶緩沖液
儀器、耗材 電泳儀
實驗步驟
1. 用低頻率切割的不同限制性內切酶分別*消化DNA。
2. 從每個反應取小份樣品作電泳分析,用已知的分子量標準作對照。剩余的樣品置于冰浴。
3. 比較分子量標準估算出DNA片段的長度,推導出每種限制性內切酶的酶切位點數(shù)目。
4. 從1的每個樣品管中取少許置另外的管中,用第二種內切酶消化,電泳分析比較酶切結果。
(1)兩種酶切割。
(2)*種酶單獨切割。
(3)第二種酶單獨切割。
5. 估算DNA片段的長度,重復此步驟,直到明確一致而且相互不矛盾的限制性內切酶位點被推導出來,DNA圖譜便告完成。
限制酶部分消化
實驗材料 DNA
試劑、試劑盒 限制酶緩沖液
儀器、耗材 電泳儀
實驗步驟
1. 用低頻率切割的不同限制性內切酶分別*消化DNA。
2. 用32P末端標記消化產(chǎn)物,5’末端可先用小牛腸堿性磷酸酶處理。
3. 用T4多核苷酸激酶進行標記。
4. 3’末端可先用大腸捍菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或T4 DNA聚合酶來標記。
5. 用第二種內切酶消化DNA片段,通過凝膠電泳分離產(chǎn)物,純化那些僅單末端帶放射性標記的DNA片段。
6. 用系列稀釋酶法以相對高頻度切割的限制酶部分消化分離的DNA片段,電泳分離片段并進行自顯影曝光。
7. 用放射性標記的DNA分子量標準,估算出片段的長度。
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