摘要：目的：建立重現(xiàn)性好，靈敏度高并且比較穩(wěn)定的液相色譜法測(cè)定馬鞭草中熊果酸含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。方法：Hypersil ODS色譜柱(4.0 mm×250 into，5 pm)；柱溫35℃；流動(dòng)相為乙腈一0.1％ 磷酸水溶液(75：25)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。結(jié)果：熊果酸進(jìn)樣量在0.624～3.120μg呈良好線性關(guān)系，平均回收率97.02％ ，RSD為0.94％(n=5)；結(jié)論：本法準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，更適用于馬鞭草藥材質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞：馬鞭草 熊果酸 液相色譜法
1 儀器、樣品、試劑
AGILENT 1 100液相色譜儀；
馬鞭草藥材購(gòu)于貴陽(yáng)市，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院陳德媛研究員鑒定為馬鞭草科植物馬鞭草Verbena officina lis L．；熊果酸對(duì)照品(742―200111，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。
2 方法與結(jié)果
2．1 色譜分析條件
Hypersil ODS(5 m，4.0 mm×250 mm，Agilent)色譜柱，乙腈-0.1％ 磷酸溶液(75：25)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃ ，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；理論板數(shù)以熊果酸峰計(jì)算不低于4000；分離度大于1.5。
2．2 樣品測(cè)定方法
2．2．1 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取熊果酸對(duì)照品適量，用甲醇溶解，制成每1 mL中含0.208 mg的對(duì)照品溶液。
2．2．2 供試液的制備精密
稱取本品粉末(過40目篩)1 g，精密加入30 mL氯仿，密塞，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用氯仿補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，回收氯仿至干，殘?jiān)檬兔?30～60℃)浸泡2次，每次10mL(浸泡約2 min)，傾去石油醚液，殘?jiān)舆m量甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用l0.45μ m微孔濾膜濾過，即得。
2．2．3 測(cè)定方法
分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算，即得。
2．3 方法學(xué)考察
2．3．1 線性關(guān)系考察
精密稱取熊果酸對(duì)照品適量，用甲醇溶解，制成每1 mL中含0.208 mg的對(duì)照品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液3，5，7，9，11，13，15μ L依次進(jìn)樣，記錄色譜圖。以熊果酸的進(jìn)樣量(μ g)為橫標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=452.418127X一1.1600976 r=0.9999(l=7)，結(jié)果表明熊果酸進(jìn)樣量在0.624～3.120 μ g范圍線性關(guān)系良好。
2．3．2 穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密吸取供試液5μL，定時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，時(shí)間間隔為0，2，4，6，8h測(cè)定結(jié)果依次為3.9348，3.9439，3.9504，3.9586，3.9642 mg /g ，供試品中熊果酸含量平均值為3.9504 mg/g，RSD=0.29％ ，結(jié)果表明試驗(yàn)方法穩(wěn)定，供試液至少在8 h內(nèi)測(cè)定較穩(wěn)定。
2．3．3 精密度試驗(yàn)
精密吸取供試液5μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定結(jié)果依次為3.9088，3.9099，3.9021，3.9177，3.9064 mg/g，測(cè)得熊果酸含量平均結(jié)果為3.9090 mg/g，RSD=0.15％ ，表明精密度良好。
2．3．4 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批馬鞭草粉末(過40目篩，按干燥品計(jì))5份，各約1 g，精密稱定，按上述方法制備供試液，測(cè)定。5份樣品熊果酸平均值為3.9448 mg/g，RSD=0.71％ ，表明方法重復(fù)性良好。
2．3．5 加樣回收試驗(yàn)
取馬鞭草粉末(過40目篩，按干燥品計(jì))5份，各約0.5 g，精密稱定，于每份中加入1.860 mg對(duì)照品，按含量測(cè)定項(xiàng)制備供試液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算熊果酸回收率，平均回收率為97.14％ ，RSD=0.94％ ，表明回收良好。
2．3．6 樣品測(cè)定結(jié)果
按上述方法和色譜條件對(duì)不同產(chǎn)地馬鞭草藥材進(jìn)行熊果酸的含量測(cè)定，同時(shí)采用薄層掃描法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示，HPLC法的誤差明顯低于TLCS法。分別測(cè)定了馬鞭草葉、莖中熊果酸的含量。
3 討論
3．1 提取條件的選擇
熊果酸為非極性的五環(huán)三萜酸，選擇甲醇、乙醇、氯仿作為提取溶劑，比較了3種提取溶劑和不同提取時(shí)間，結(jié)果甲醇、氯仿對(duì)熊果酸的提取率基本一致，均高于乙醇。由于氯仿提取物中極性較大的雜質(zhì)少，測(cè)定時(shí)干擾小，故選用氯仿為提取溶劑，超聲提取1.0 h，較為適宜。
3．2分離條件的選擇
根據(jù)查閱文獻(xiàn)資料，對(duì)熊果酸的分離多選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；故本文選擇了3種色譜柱：(1)Hypersil ODS(5 m，4.0 mm×250 mm，Agilent)色譜柱，(2)HypersilODS2(5 am，5 mm×200 mm，大連依利特)色譜柱，(3)Diam0nsi (鉆石)HPLC C18(5 m，4.6 mm×250 mln，迪馬公司)色譜柱；及4個(gè)流動(dòng)相：(1)甲醇．水(88：12)；(2)甲醇-0.1％ 磷酸溶液(80：20)；(3)乙腈一水(80：20)；(4)乙腈-0.1％磷酸溶液(75：25)進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)果表明：在色譜條件：Hypersil ODS(5 m，4.0 lmTl×250mm，Agilent)色譜柱，乙腈-0.1％磷酸溶液(75：25)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃ ，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，供試品中熊果酸得到較好分離，理論板數(shù)達(dá)到6000，分離度R=2.20。
3．3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定
熊果酸于190～400 nm波長(zhǎng)下掃描，zui大吸收波長(zhǎng)為195 nm，為紫外末端吸收。在210 nm波長(zhǎng)處熊果酸吸收峰靈敏度較高，其他色譜峰干擾較小，熊果酸色譜峰的分離zui為理想，
故選用(210±1)nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
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